家蚕抗bmnpv品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析.pdf

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, February 25; 24(2): 285-290 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2008 Institute of Microbiology, CAS Accepted: May 10, 2007 Supported by: the National Basic Research Program of China (No.2005CB121000), and the Project from Jiangsu University the Youth Science Funds (No.1241330001). Corresponding author: Keping Chen. Tel: +86-511-8791923; E-mail: kpchen@ 国家“973”计划 (No. 2005CB121000)和江苏大学青年科学基金资助项目(No. 1241330001)。

研究报告家蚕抗 BmNPV 品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差 异分析 蔡克亚, 陈克平, 刘晓勇, 姚勤, 李军 江苏大学生命科学研究院, 镇江 212013 摘 要: 利用遗传学的原理, 通过杂交和回交的方法, 建立家蚕抗 BmNPV、 感 BmNPV 以及近等基因系模型, 利用 2-D电泳和 MALDI TOF/TOF MS 质谱技术, 从蛋白质组水平上研究家蚕对 BmNPV 抵抗性 其结果是获得家蚕高抗 NB, 高感 306, 近等基因系 BC8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱, 分别获得 180、190、187 个蛋白点, 其中 80%的蛋白点集中在等电点 5∼9 范围之内从三块凝胶上共获得明显差异蛋白点 12 个, 由质谱鉴定出 5 种蛋白, 其中氨基酰化酶(Aminoacylase)仅出现在抗性品系 NB、近等基因系图谱中, 感性品系没有出现, 初步推测是家蚕抗 BmNPV 特有蛋白, 这是首次报道结果 关键词: 2-D 电泳, MALDI TOF/TOF MS, 蛋白质组, 抗核型多角体病毒, 家蚕 Differential Expression of Haemolymph Proteome of Resistant Strain and Susceptible Strain for BmNPV in Bombyx mori L. Keya Cai, Keping Chen, Xiaoyong Liu, Qin Yao, and Jun Li Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China Abstract: Three model silkworms, highly resistant strain, highly susceptible strain and their near isogenic line were established by hybridization and backcross. The resistance of silkworm (Bombyx mori L.) to BmNPV was studied at proteomic level using two-dimensional gel electrophoresis and MALDI TOF/TOF MS. Differential expression profiles of proteome in resistant strain, sus- ceptible strain and near isogenic line were obtained, and 180, 190 and 187 of protein spots were shown, respectively. Among them, 80% were concentrated in pI 5~9. Twelve differential protein spots in total were obtained from 3 gels. Using MALDI TOF/TOF MS, five proteins, including aminoacylase, were identified from these spots. The exclusive expression of aminoacylase in highly resistant strain and near isogenic line and its absence in susceptible strain suggest that it might be a BmNPV-resistance related protein. Keywords: two-dimensional gel electrophoresis, MALDI TOF/TOF MS, proteome, resistibility to BmNPV, silkworm Bom- byx mori L.) 家蚕饲养在世界上已经有 5000 多年的历史了, 在很多国家它是作为很重要的经济来源, 特别是在中国, 印度, 越南和其他一些发展中国家。

同时, 家蚕又作为一种重要的模式昆虫, 在生命科学研究领286 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2008 Vol.24 No.2 J 域发挥了重要作用[1] 在蚕业界, 病毒是一种危害巨大的病原物, 尤其是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori L. Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)对蚕业生产危害极大, 大约占蚕病给蚕茧造成损失的 70%左右[2]因此, 挖掘家蚕抗 BmNPV 种质资源、阐明致病机制、寻找抗病基因, 对培育抗性品种和病毒病防治具有重要的意义 长期以来, 很多科学研究人员把家蚕抗核型多角体病毒病作为重点研究对象但是, 由于没有发现家蚕对 BmNPV 高抗的资源, 因此, 其研究主要放在家蚕感病分子机制上[3]自 1991 年, 我国学者从中国的家蚕资源库中发现高抗 BmNPV 新的资源以来[4], 对家蚕抗性研究才有了新的认识和进展近几年, 有从DNA水平上筛选抗性分子标记[5], 也有从mRNA水平上通过 DD-PCR 技术筛选抗性和感性差异基因[6−8]。

2004 年有报道从家蚕中肠消化液中分 离出丝氨酸蛋白酶和脂肪酶以及相应的 serine 和 liptease 基因[9,10]从现有文献看, 家蚕抗 BmNPV 的研究还停留在致病机理、传染途径、DNA 分子标记和转录水平上, 家蚕蛋白质组水平研究还是刚起步阶段[11,12], 尤其对家蚕抗 BmNPV 蛋白组水平的研究尚无报道 1 材料和方法 1.1 家蚕品系及近等基因系的组配 抗 BmNPV 品系 NB, 感性品系 306, 以及近等基因系 BC8由本实验构建和保存BC8是用 NB 和306 杂交成 F1 代, 再用 306 作为轮回亲本连续回交8 次后得到该近等基因系遗传背景与 306 品系99.9%相同, 但带有 NB 的抗病基因[13] 1.2 饲养方法及取样 NB, 306, BC8家蚕品系在室温 24℃~28℃, 空气相对湿度在 65%~80%, 光照周期 12 h 照明, 12 h 黑暗的条件下, 用新鲜的桑叶来饲养家蚕到五龄起蚕时取血淋巴液, 每 EP 管收集 10 头蚕血淋巴液分装, 放−80℃保存备用 1.3 二维电泳 第一维等电聚焦: 家蚕血淋巴液直接上样, 样品使用 DC-RC 法(Bio-Rad 公司试剂盒)进行蛋白定量。

样品和水化液(7 mol/L urea, 2 mol/L thiourea, 4% CHAPS, 0.2% Bio-Lyte, 65 mmol/L DTT 和 0.001% bromophenol blue)按 1： 4 上样, 上样总体积为 160 μL把胶条(pH 3~10, 7 cm)放在等电聚焦槽, 室温放置 1 h, 让胶条充分泡涨, 在 50 V 电压, 20℃条件下采取主动水化 13 h等电聚焦设置分为六步, 分别为: ①250 V, 25 min; ②500 V, 60 min; ③1000 V, 60 min; ④4000 V, 3 h; ⑤4000 V, 20000 Vhours; ⑥500 V, 2 h等电聚焦结束后进行两步平衡 (平衡母液为 50 mmol/L Tris base, 6 mol/L urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 0.002% bromophenol blue), 每次 15 min: 第一步用含 2%的 DTT 平衡母液平衡, 第二步采用2.5%的碘乙酰胺代替 DTT 来平衡 然后进行第二维SDS-PAGE 电泳。

第二维 SDS-PAGE电泳: 配制 12%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶, 平衡后的胶条转移到 SDS-PAGE 胶上, 用低熔点琼脂糖封胶, 电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸-SDS先用 70 V 电压电泳 15 min, 然后用 120 V 电压电泳至到溴酚蓝到达底部为止 1.4 凝胶的染色与图象分析 凝胶采用银染试剂盒染色(Bio-Rad 公司), 利用SanMaker 9700XL 进行图象采集, 分辨率在 600dpi状态下扫描, 用 PDQuest 对胶进行背景的消减和点的检测等分析处理 1.5 质谱分析 质谱样品处理与分析: 用切胶笔取点后, 用超纯水洗 3 次, 用 25 μL 的 15 mmol/L K3Fe(CN)4和 25 μL 的 50 mmol/L Na2SO41： 1 混合脱色, 最后用乙腈脱水, 真空干燥, 胰蛋白酶(Promega 公司)酶解过夜, 取 1 μL 样品与 1 μL 基质α-腈基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA)混合均匀点样用 MALDI TOF/TOF MS(Bruker 公司)质谱得到肽质量指纹图谱(PePtide Mass Fingerprinting,PMF)数据后, 利用 MASCOT 程序比对分析。

2 结 果 2.1 家蚕抗 BmNPV、、感 BmNPV 以及近等基因系 血淋巴液蛋白差异表达谱 本研究中共获得 NB、 306、 BC8 3 个品系血淋巴液总蛋白二维电泳图谱(图 1)银染以后获得了180∼190 个蛋白点(NB 180 个点, 306 190 个点, BC8187 个点) 从凝胶上可以看到, 大部分的点是集中在等电点 5~9 之间, 并且在 BC8上的蛋白点大部分都可以在 NB 和 306 两个品种上找到对应的蛋白 蔡克亚等: 家蚕抗 BmNPV 品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析 287 J 图 1 家蚕血淋巴液蛋白表达比较 Fig. 1 Comparison of protein expression of silkworm haemolymph (A): NB; (B): BC8; (C): 3。