富含花青素植物的筛选及改善动脉粥样硬化的作用机制之农学研究.docx

富含花青素植物的筛选及改善动脉粥样硬化的作用机制之农学研究本文是一篇农学论文，本课题通过设计正交实验，采用室温组织破碎提取法同时结合超声提取法优化了花青素的最佳提取工艺，采用大孔吸附树脂柱色谱法优化了花青素的富集纯化工艺，获得了制备花青素纯化物的最佳工艺该工艺方法具有提取快速充分、完全，采用室温提取、低温快速高效浓缩，最大限度的保留了花青素成分不受破坏，花青素的保留率和转移率高等特点1 文献综述1.1 花青素研究进展1.1.1 花青素植物资源研究进展花青素广泛存在于植物的液泡中，使植物呈现红色、紫色或蓝色目前在我们吃的食物中越来越常见最早最丰富的花青素是在 1879 年由意大利人从红葡萄渣中提取得到[4]后来人们发现野生蓝莓也富含花青素[5]Mizgier 等人研究发现紫胡萝卜和紫甘蓝中含有花青素，且其中大部分为酰基化花青素[6]Antonia 等人发现黑醋栗中总花青素含量在 205±29 ~ 2110±376μgCyG/100 g，并鉴定出矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药色素-3-O-葡萄糖苷等五种不同的花色苷[7]到目前为止，在被子植物中已有 27个科 73 个属被发现含有花青素。

1.1.2 花青素提取与纯化技术研究现状 花青素还是一种天然水溶性色素，美国、日本等发达国家很早将花青素作为色素运用于食品和饮料中，花青素作为天然色素，易溶于水、无毒、无害、安全性高、而且着色度亮丽[3]花青素口服后在胃和小肠中能被快速吸收，但生物利用度仅有0.004%-0.1%[8]因此提取纯化花青素并对花青素生物活性研究具有重要意义提取花青素传统的提取方法是溶剂萃取法，常用甲醇、乙醇、丙酮、水或混合溶剂等直接浸提一定时间后来发现非酰基化的花青素在提取过程中会降解，因此在提取溶剂中加入 1%盐酸或甲酸[9]李菊梅等人用盐酸-乙醇溶液萃取葡萄皮渣中的花青素[10]但是这种提取方法耗时长，溶剂耗费多且提取效率低在缩短提取时间的基础上，Arapitsas 等人[11]利用加压萃取了紫甘蓝中的花青素，通过增加压力来提高溶剂的沸点，从而增加花青素在乙醇溶剂中的溶解度，提高了提取效率Sun 等人[12]用微波辅助提取红树莓中的花青素为 363.9 μg/g FW顾红梅[13]等人将超声波提取法和溶剂萃取法提取的紫薯花青素进行对比，发现超声法提取提取时间短，且能避免热敏性花青素因温度升高而被破坏， 大大提高了提取效率。

近年来，组织破碎提取法被广泛运用于中药成分的提取，该方法能在数十秒内将植物破碎成微颗粒，使 80%的有效成分快速溶解转移到溶剂中，极度适合热敏性和易受空气影响的成分的提取，具有提取时间短、效率高、适用材料广、溶剂用量小、操作简单，节约能源等优势邓引梅[14]等人利用闪式破碎提取法提取的甘草叶中的总黄酮高达 2.91%曹站霞[15]利用破碎提取法提取了葡萄籽中总多酚成分金小燕[16]等人利用闪式破碎提取法提取了甘蔗皮中的原花青素，均取得了好的试验效果 .......................... 1.2 黑枸杞花青素研究进展 黑枸杞(Lycium ruthenicum)，系茄科，枸杞属植物，又名黑果枸杞主要分布在我国西北部、中亚、欧洲等地区，是一种典型的荒漠植物，耐干旱、耐盐碱、耐贫瘠，具有保持水土流失和土地沙漠化的作用[42]据藏医药典记载，黑枸杞主治心热病、心脏病和月经不调等[43]黑枸杞的果实成熟后呈现紫黑色，富含花青素、氨基酸、多糖、维生素和微量元素等成分黑枸杞中天然色素-花青素受到了学者们的广泛关注目前关于黑枸杞花青素的研究大部分集中在对其花青素的提取纯化、成分鉴定及含量分析上。

刘增根等[44]人对我国西北种植黑枸杞的地区进行调查发现，不同产地黑枸杞花青素含量差异较大，同一产地差异不显著，但青海柴达木地区种植的黑枸杞花青素含量最高有研究报道，黑枸杞是目前花青素含量最高的食物，被称为"花青素之王";，其花青素含量约为蓝莓的 5-10 倍[45]刘振华等[46]人利用单因素和正交试验考察出最佳提取工艺为用 65%的乙醇溶液，料液比 1:13，在 55℃浸提 2.5 小时，提取率最高为0.424%杨萍等[47]人用 65%的乙醇溶液采用微波辅助提取黑枸杞花青素，提取率提高到 2.15%，并发现黑枸杞花青素在 pH3 左右的酸性、低温、避光、远离金属离子的环境下稳定性最好Zheng 等[48]人利用甲醇浸泡提取和 HPLC-DAD 和 HPLC-ESI-MS分析，鉴定出 15 种花青素成分，其中 95%的为矮牵牛素衍生物关于黑枸杞花青素的生物活性研究，目前报道了黑枸杞花青素对 DPPH、O2-和OH 自由基都具有极强的清除能力，且抗氧化性要显著强于单宁酸，其抗氧化能力与浓度成正相关性[49-51]Yin 等[52]人发现黑枸杞花青素能明显抑制炎症和增加脂肪酸代谢以改善肥胖症。

Tang 等[53]人发现黑枸杞花青素中一种矮牵牛素衍生物可以促进抗氧化酶活性和细胞增殖抑制脂质过氧化反应，从而保护了 PC12 细胞免受过氧化氢的损害 ................................ 2 花青素提取与纯化工艺优化 2.1 试验材料 本章以颜色较深，且含水量适中，资源广泛、价格便宜的紫胡萝卜为代表考察了花青素的提取纯化工艺紫胡萝卜于 2017 年 5 月采摘于山东聊城的立源美农特色农产品基地 随着花青素的营养价值及功效被人们广泛熟知，出现了越来越多的富含花青素的植物，包括蓝靛果、桑葚、紫甘蓝、紫花菜等等这些植物不仅含有鲜艳的色彩，增加了植物的观赏价值，而且还是天然色素的良好来源，具有无毒、强抗氧化性的特性[88]为了提高花青素的利用，常常需要对植物中花青素成分进行提取纯化，但花青素稳定性差，容易受 pH、温度和氧气的影响[89]，因此选择恰当的方法提取纯化花青素， 对确保功效成分的存留和活性至关重要组织破碎提取法将粉碎和提取过程合二为一同时完成，具有提取速度极快、效率高、室温提取，能最大限度的保留热敏性成分不受破坏等特点。

根据花青素结构的敏感特性，本研究选择将组织破碎提取法和超声提取法结合并用，对 15 种富含花青素植物采用优化的工艺进行高效快速提取，并利用大孔树脂柱色谱法对花青素提取物进行富集纯化，采用低温闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩，得到了花青素纯化物 ........................ 2.2 实验方法 2.2.1花青素破碎提取工艺考察 以紫胡萝卜为代表考察花青素的最佳提取工艺按照表 2.1 的 L934正交试验表，采用四因素三水平进行设计，每一次正交实验的结果用紫外分光光度计测定在 510nm处的吸光值表示，根据吸光值大小考察和筛选组织破碎提取法的最佳工艺每一组实验平行操作 3 次，取平均值 2.2.2花青素超声提取工艺考察 通过破碎提取已将植物打碎成匀浆状，并将植物细胞中的大部分花青素成分快速转溶于溶剂中，通过过滤得到提取液但由于提取时间短，滤渣中仍残存部分花青素成分为了增加提取率和便于过滤，不宜继续用破碎提取法提取，而是结合超声提取法将滤渣在室温下再次提取超声提取工艺优化采用表 2.2 的 L933正交试验法，采用三因素三水平进行设计每一次正交实验的结果通过测定在 510nm 处的吸光值表示，根据吸光值大小考察和筛选超声提取法的最佳工艺。

每一组实验平行操作 3 次，取平均值 /> ........................ 3 15 种植物花青素纯化物的性能评价 ................................... 143.1 试验材料 ...................................... 143.2 仪器与试剂 ................................. 144 黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化实验研究 ............................. 374.1 材料与试剂 .................................. 374.2 仪器与设备 ................................ 375 黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化的机制研究 .............................. 485.1 实验材料与仪器 ................................ 485.2 主要仪器 ....................... 485.3 实验方法 ................................. 495 黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化的机制研究5.1实验方法5.1.1小肠组织病理学检测取新鲜小肠组织进行 H&E 染色，方法同 4.4.7。

5.1.2组织蛋白的提取与浓度测定（1）称取 0.2 克动脉和 0.1 克肝脏组织块用冷 PBS 洗涤 2-3 次，去除血污，剪成小块放入匀浆器中，并加入 1mL 的蛋白酶抑制剂，磁珠震荡 30 秒然后将装有匀浆液的离心管，振荡，冰浴 30 分钟，期间用移液器反复吹打，确保组织细胞完全裂解最后在 4℃，12000 转条件下离心 10min，收集上清液，即为总蛋白溶液 （2）根据 BCA 试剂盒说明测定提取的总蛋白浓度，制备的标准曲线如图 5.1 所示，在 562nm 波长处检测吸光值，再根据标准曲线定量各组织样本的蛋白浓度 /> .......................... 6 结论 目前有效缓解和治疗动脉粥样硬化的药物主要为一些他汀类药物，这些药物又会引起便秘、肝损伤等副作用，因此寻找天然产物有效缓解动脉粥样硬化并分析其作用机制是当前的研究热点花青素具有极强的抗氧化活性和预防心脑血管疾病的作用，并且市面上出现了越来越多富含花青素的植物 本文在充分查阅大量文献的基础上，选择了 15 种富含花青素的植物为研究对象，将破碎提取法和超声提取法结合使用，以紫胡萝卜为代表利用正交试验优选出了最佳提取工艺为：以 pH 为 2 的 50%乙醇溶液，按料液比为 1:4 组织破碎提取 1.5min，抽滤，将滤渣再用 pH 为 2 的 50%乙醇溶液按料液比 1:2 在室温超声提取 40min，提取1 次。

抽滤，合并滤液在 40℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的 1/5，得浓缩液再通过 Diaion HP 2 MGL 大孔树脂进行富集纯化浓缩液上样后先用去离子水洗脱，除去水溶性杂质，再用 pH 为 3 的 60%的乙醇溶液洗脱，收集花青素色带洗脱液，40℃下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干粉，得到花青素纯化物 采用 pH 示差法和 HPLC 法对 15 种植物花青素纯化物中花青素的含量进行测定并评价了其 DPPH、FRAP、TRP 的抗氧化活性和在不同 pH、光照、温度条件下的稳定性结果分析发现：浆果类植物的花青素纯化物中总花青素含量和抗氧化活性要显著高于蔬菜类植物；其中浆果类的黑枸杞植物花青素纯化物干粉得率和总花青素含量均为最高，分别为 5.57%和 381.57±7.40 mg/g DW然而仅检测出 8 种植物中含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，其中蓝靛果花青素纯化物的含量最高黑枸杞花青素纯化物的抗氧化活性在这 15 种植物中也都是最高的，且其水溶液在酸性低温避光的条件下稳定性更好因此筛选出黑枸杞植物进行研究其对动脉粥样硬。