用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型.docx

1 材料与方法1. 1. 2主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640培养液（含L-谷氨酰胺，）、Hanks液（HyClone）、MTT试剂、PBS缓冲溶液（pH值7. 2〜7. 4, HyClone）、丝裂霉素C、SA缓 冲液，绵羊红细胞，补体（豚鼠血清）、都氏试剂、LDH基质液、 P815细胞（购于协和医科大学基础医学细胞中心）、YAC-1细 胞、FITC-Anti-CD3、 PE-Anti-CD4、 PerCP-Anti-CD8 荧光抗体）1. 2 动物与分组Balb /C小鼠90只，雌性，6〜8周龄，体重18〜22g颗粒饲 料，室温（22 土 2）°C，湿度60%〜80%动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，（1）处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;（2） 处理二: 测定NK细胞活性，细胞毒性T细胞活性；（3）处理三:测定血 清半数溶血值每项处理随机分为空白对照组、CTX-1组和 CTX-2 组1. 3 实验方法和测定指标1. 3. 1剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1组的CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给 予。

CTX-2组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］（ 用蒸馏水配制）另 设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4周 后测定各项免疫指标1. 3. 2血液中T、B淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3支流式试管进行 测定，每管加入50ul抗凝血分别在3管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体每管加 入2ml FACS红细胞裂解液，室温下避光保存20min1200r / min离心5min，弃去上清液每管再加入2ml PBS， 1200r /min 离心5min，弃去上清液加入0. 5ml PBS混匀后上流式细胞仪进行 检测1. 3. 3细胞毒性T淋巴细胞活性试验［5, 6］1. 3. 3. 1脾细胞悬液的制备（ 效应细胞） 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液用Hank's液洗2次，每次离 心10min（1000r /min）弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank' s液，混匀后1000r / min，10min离心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 X 107个/ml;加0. 5ml此细胞悬 液于24孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。

1. 3. 3. 2制备刺激细胞1000r /min，10min离心处于对数生 长期的P815细胞，用5ml DMEM培养液悬浮P815细胞于 15ml离心管中，计数细胞加入丝裂霉素C，相当于50ug / （2 〜5） X 107个细胞用锡纸包裹离心管以避光，在37C水浴 30min用Hank' s液洗P815细胞3次，之后Hank' s液悬浮P815细胞，室温孵育15〜20min后，离心1次将P815悬浮 于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 X 106个/ ml,加0. 5ml此悬液于含有脾细胞悬液的24孑1（包括对照孔） 板中37°C、5% CO2孵育5天5天期间，每隔一天换一次液1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用 Hank' s液洗1次，200r /min离心10min，收集细胞，重悬于 RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 X 107 / ml用完全培养液配制3个系列稀释的细胞悬液，每个稀释 度100U1,做3个复孔1. 3. 3. 4制备靶细胞离心处于对数生长期的P815细胞， 重悬于0. 5ml Hank' s液里，离心后重悬于RPMI1640完全培 养液，调整细胞浓度为2 X 105个/ml。

1. 3. 3. 5 CTL检测按效应细胞和靶细胞比为100 : 1、50： 1、 25 : 1和12. 5 : 1（各加100ul）在圆孔96孔培养板的培养孔中 加入细胞，每孔液体总体积为200 ul，设3个复孔同时设靶 细胞自然释放对照组（0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液） 和最大 释放对照组（0. 1ml靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40液），效应细胞 对照孔（0. 1ml 效应细胞+ 0. 1ml 培养液） ，用96 孔板水平转 头500r /min 离心5min， 37C、5% CO2 培养4 〜6h1000r /min 离心5min，每孔吸取100ul上清，加于另一ELISA反应板的 孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50ul，室温避光反应 30min后，每孔加入50ul终止液，终止酶促反应在酶联检 测仪492nm波长下读取各孔A值，CTL活性用杀伤率表示， 按如下公式计算:CTL杀伤率（％ ）=（实验孔A值一靶细胞 对照孔A值一效应细胞对照孔A值）/ （靶细胞最大释放孔A 值一靶细胞对照孔A值）X 100%1. 3. 4 NK 细胞活性测定1. 3. 4. 1靶细胞传代实验前24h将靶细胞进行传代培养， 应用前以Hank' s液洗2次，用RPMI1640完全培养液调整细 胞浓度为4 X 105 个 /ml。

1. 3. 4. 2 效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度效应细胞的数量为5 X 106个/ml，效应细胞和靶细胞之比为50 : 11. 3. 4. 3 NK细胞活性测定反应孔加靶细胞和效应细胞各 100ul于96孑LU形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和 培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%的NP40 或2. 5% Tri ton各100ul，每样做3个平行样37C、5% CO2 条件下培养4h培养结束后，96孔培养板1500r /min离心 5min，每孔吸取上清100ul置于平底96孔板中，同时加入 LDH基质液100ul，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L的 HCl 30 u l，在酶标仪490nm处测定A值用下列公式计算： NK细胞活性（％ ）=（反应孔A值一靶细胞自然释放孔A 值）/ （最大释放孔A值一靶细胞自然释放孔A值）X 100%1. 3. 5半数溶血值的测定（HC50）1. 3. 5. 1制备补体采集豚鼠血，分离出血清( 至少5只豚 鼠的混合血清)，将lml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中， 放4°C冰箱30min,经常振荡，离心取上清，分装，一70°C保存。

用时以SA液按1： 8稀释第3 期齐丽娟，等. 用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型315 1. 3. 5. 2免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞(SRBC)，并用生理盐水配成2% (V /V)的细胞悬液，每只鼠腹 腔注射0. 2ml进行免疫4〜5天后，由动物眼眶内眦静脉取 血，2000r /min离心10min收集血清1. 3. 5. 3溶血反应取血清用SA缓冲液稀释(一般为 200〜500倍)将稀释后的血清1ml置试管内，依次加入 10% SRBC 0. 5ml，补体1ml(用SA液按1： 8稀释)另设不加 血清的对照管(以SA缓冲液代替)置37C恒温水浴中保温 15〜30min后，冰浴终止反应2000r /min离心10min取上 清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml加都氏 试剂至4ml，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管 作空白，分别测定各管光密度值按下列公式计算HC50HC50 = 样品光密度值SRBC 半数溶血时的光密度值X稀释倍数1. 4 统计分析采用SPSS 13. 0统计软件进行方差分析或非参数检验2结果2. 1 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠体重及免疫器官重 量的影响由表1可见，CTX-1组和CTX-2组小鼠体重较对照组显 著降低(P < 0. 001)。

CTX-1组小鼠脾脏绝对和相对重量较 对照组增高(P < 0. 001)，CTX-2组小鼠脾脏绝对和相对重量 较对照组降低(P < 0. 001，P < 0. 05) 表1 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠体重及 免疫器官重量的影响Table 1 The weight and absolute and relative spleen weight in each group( n = 8, 珔x 土 s) 组别体重( g)脾脏 绝对重量( g) 相对重量(% ) 对照组22. 36 土 1. 06 0. 071 土 0. 007 0. 319土 0. 031 CTX-1 组16. 31土 2. 05 (3) 0. 081土 0. 018 (1) 0. 505土 0 142 (2)CTX-2 组19. 18土 0. 48 (3) 0. 047土 0. 009 (2) 0. 243土 0 042 (1)注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P < 0. 0012. 2 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠淋巴细胞分类计数 的影响由表2可见，CTX-1组小鼠外周血LYM和LYM(% )、B淋巴细胞( CD －3 CD +19) (% )、T 淋巴细胞( CD +3 CD －19) (% )、 Th细胞(CD +3 CD +4 CD —8) (% )和Ts 细胞(CD +3 CD —4 CD + 8) (% )及Th /Ts比值均较对照组显著降低(P < 0. 05) ;CTX-2组 小鼠外周血LYM和LYM(% )、B淋巴细胞(％ )较对照组降低(P < 0. 001) ; CTX-2组小鼠外周血T淋巴细胞(％ )、Th细胞(% )、Ts细胞(％ )及Th /Ts比值较对照组增高(P < 0. 001， P < 0. 001，P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 001)。

表2 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠外周血淋巴细胞分类计数的影 响Table 2 Phenotypic analysis results of peripherial blood T lymphocytes in each group( n = 8, 珔x 土 s)组别CD —3 CD +19(% ) CD +3 CD—19(% ) CD +3 CD +4 CD-8(% ) CD +3 CD—4 CD +8(% ) Th /Ts(% ) LYM LYM(% )对照组15. 76土 7. 29 49. 88土 8. 58 29. 90土 13. 33 11. 08 土 5. 18 2. 29土 0. 70 16. 60土 6. 20 67. 13土 7. 79 CTX-1 组0. 20土 0. 17 (3) 4. 03土 2. 00 (3) 1. 12土 1. 37(3) 1. 34土 0. 84 (3) 0. 72土 0. 41 (3) 2. 89土 1. 95 (3)56. 11土 15. 96 (2)CTX-2 组3. 31土 1. 74 (3) 88. 37土 2. 95 (3) 65. 53土 23.69 (1) 15. 96土 1. 38 (1) 4. 14土 1. 60 (3) 1. 97土 2. 28(3) 11. 72土 3. 51 (3)注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P。