柱层析分离色素.docx

柱层析分离色素实验目的1 .进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质2 .学会用柱层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%醇或无水乙醇提取分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定分配柱色谱是以硅胶、硅藻土和纤维等为支持剂，以吸附较大量的液体作为固定相，而支持剂本身不起分离作用。

本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醴提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离在选择溶剂时主要依据下面几条原则：（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱2）溶剂和吸附剂不能起化学反应3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂这样既降低了极性，又减少了溶液的体积层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择一般来说，细长的柱分离效果较好若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。

叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a（C55H7?QN4Mg）和叶绿素b（C55HoQNMg）,其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代它们都是叱咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的姓:基结构使它易溶于醴、石油醴等一些非极性的溶剂胡萝卜素（CwHk）是具有长链结构的共腕多烯它有三种异构体，即a-,B-和丫-胡萝卜素，其中B-异构体含量最多，也最重要在生物体内，B-体受酶催化氧化即形成维生素A目前B-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素叶黄素（C40H6Q）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醍中溶解度较小可用有机溶剂将上述色素萃取出来而后用层析柱，以同样的或其他混合有机溶剂当洗脱剂，便可将这些色素分离试剂器材材料烘干的菠菜叶试剂无水乙醇，石英砂，丙酮，石油醴（60-90°C）,三氧化二铝,饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠，洗脱液（丙酮：石油醴=1:9）器材层析柱（1X30cm）,研钵，蒸储装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台实验步骤色素提取取20g青椒，加少许石英砂，再加20mL无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤,保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30mL石油醴提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，再加入40mL饱和氯化钠溶液震荡（注意不要激烈振荡，以防止发生乳化现象）。

弃去下层溶液，再分别加入20mL水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至锥形瓶中，用无水硫酸钠干燥5min,备用样品浓缩将提取液放入蒸储烧瓶中，蒸除多余的石油醴，至剩10mL时停止加热，用余热加热至剩余5~8mL,以备加样使用层析柱的制备称取12g碱性三氧化二铝加入30mL石油醴搅拌，浸泡10min在层析柱内加入一团棉花（棉花要尽量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醴半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醴，直到装完用石油醴洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再加入石英砂0.5cm高样品的分离层析将浓缩液小心地从柱顶部加入加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醴冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前，在柱顶小心加入约1.5—2cm高度的石油醴-丙酮洗脱剂，层析即开始进行当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的烧杯收集，得黄色溶液，即胡萝卜素将洗脱剂换成1:7的石油醴-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素a和叶黄素实验结果从左到右依次为：胡萝卜素（黄色），叶绿素a（蓝绿色），叶黄素（黄绿色），叶绿素b（绿色）实验总结在该柱层析分离色素实验中，了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。

洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素同时在实验过程中，为保证实验快速有效地进行，也需要注意以下问题：1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀5、注意洗脱剂的配比，胡萝卜素出来后，换成1:7的洗脱液60〜80滴6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松,导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢因此应控制洗脱流速，以每分钟为宜7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大或过小。