栉孔扇贝介导的肽聚糖识别蛋白.docx

栉孔扇贝（CfPGRP- S1 ）介导的肽聚糖识别蛋白——针对细菌感染的免疫防御系统Jialong Yanga,b, Wan Wanga,b, Xiumei Weic, Limei Qiua, *, Lingling Wanga, Huan Zhanga,b, Linsheng Songa, *中国，山东青岛266071,南海路7号，中国科学院，中国科学院海洋研究所，实 验海洋生物学重点实验室中国，北京100049，中国科学院研究生院，研究所，中国，青岛266003，中国海洋大学，水产动物病理学和免疫学重点实验室，文章信息 文章历史： 2010年6月25 日接收 2010年8月9日修订 2010年9月8日接受 2010年8月21日在网上提供关键词：栉孔扇贝 PGRP 先天免疫模式识别受体酰胺酶摘要：肽聚糖识别蛋白（PGRP）在无脊椎动物和脊椎动物先天免疫中，由于其在 检测和消除入侵的细菌的突出能力至关重要几个PGRPs已从软体动物中确定， 但其功能和下划线的机制目前仍不清楚在本研究中，信使核糖核酸的表达谱、 位置和可能的功能，从直孔栉孔扇贝（CfPGRP- S1）的PGRP- S1进行了分析。

地幔CfPGRP- S1位于蛋白，鳃，肾和扇贝的生殖腺血细胞中的信使核糖核酸 符号在PGN刺激后被急剧上调，而LPS的刺激后（P <0.01）和-葡聚糖（P <0.05） 的上调是中度的CfPGRP- S1的重组蛋白（指定为rCfPGRP- S1）具有较高的 PGN和对LPS的中度亲和力，但它没有约束力-葡聚糖同时，rCfPGRP- S1 也表现出对革兰氏阳性菌藤黄微球菌和枯草芽抱杆菌的强烈凝集活性，而对革兰 氏阴性菌大肠杆菌表现出弱的凝聚活性更重要的是，rCfPGRP-S1充当了降解 PGN的杀菌酰化酶，并在有Zn2 +存在的情况下强烈抑制大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌的生长这些结果表明，CfPGRP- S1不仅可以作为一种识别细菌的PGN 和LPS的模式识别受体，还是一个参与了消除对入侵者反应的清道夫©2010爱思唯尔有限公司保留所有权利1、简介无脊椎动物缺乏适应性免疫，他们完全依赖自己的先天免疫反应来有效抵御 各种病原体（Beutler，2004年；Loker等，2004）在众多的先天免疫力，有害 的非自治领土的模式识别受体介导的歧视自我反应（PRRS）是首要和关键的一步 （2002年，詹韦和Medzhitov; Medzhitov和詹韦，2002年）。

PRRS是生殖系编码分子，旨在识别一些存在于病原体的高度保守的结构，称为与分子模式相关的 病原体（PAMPS）,例如来自细菌的脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）来自真菌的-1,3- 葡聚糖、来自病毒的双链RNA （詹韦和Medzhitov, 2002; Medzhitov和詹韦， 2002年）等PRRS至少有六组，包括肽聚糖识别蛋白（PGRP）,含有硫酯蛋白（TEP）， 脂多糖和T, 3 -葡聚糖结合蛋白（LGBP），清道夫受体（SRCR）, C型凝集素（CTL） 半乳糖凝集素（烈风），这些都确定出自无脊椎动物（Christophides等，2002） 其中，PGRP是唯一一个专门识别细菌PGN的，包括革兰氏阳性菌李斯特GN和革 兰氏阴性菌DAP型二胺庚二酸（Schleife等人，1972年；施泰纳，2004年）PGRPs是无脊椎动物和脊椎动物中的保守分子（Dziarski2004年）第一 PGRP被确定为出自家蚕的血淋巴和角质层的19 kDa蛋白质（Yoshida等， 1996）随后，PGRP基因已被确定在许多生物，尤其是在昆虫和哺乳动物 （Christophides 等，2002;康等，1998; Tydell 等，2002年。

沃纳等，2000） 已有十三种不同的PGRP基因从果蝇中确定，和四种从人类中确定 （Christophides等，2002;康等，1998;沃纳等人，2000年）在预测结构的基础 上, PGRPs分为三大类：20-25 kDa的小夕卜PGRPs（PGRP- S）的，中间PGRPs（PGRP- I） 40-45 kDa的两个预测跨膜结构域，和长期PGRPs高达90 kDa的 细胞内或跨膜蛋白的（PGRP- L） （Ni等人，2007年）PGRPs的类别和结构的 多样性表明PGRPs的先天免疫系统的多种功能虽然PGRPs最初是作为无脊椎动物和脊椎动物一个关键的PRRS（古普塔， 2008年Girardin和菲尔波特，2006年仓田，2004年）确定的，也有越来越多的 证据证明PGRPs执行多功能一般来说，它们的功能分类至少有三个类别，包 括：（1）作为PRR承认并结合细菌PGN （Gelius等，2003; Kang等人，1998 年Yoshida等，1996）,然后激活或抑制下游的免疫反应,如前酚氧化酶（proPO） 系统（竹鼻等人，2002年，吉田等人，1996年，TOLL和IMD通路（Choe 等, 2002），霍夫曼和Reichhart, 2002年，米歇尔等人，2001）,或JNK通路（比 绍夫等人，2006年。

Maillet 等，2008; Zaidman -雷米等人，2006年）2） 作为N -乙酰胞壁酸L -丙氨酸一酰胺酶（NAMLAA） （Coteur等，2007; Gelius 等，2003;李等，2007; Mellroth 和 Ste in er, 2006年，Zaidma n-人头马等2006 年），切割细菌PGN中胞壁酸和肽链之间的酰胺粘合剂，并展示其像T7溶菌酶 的杀菌活性（Gelius 等，2003; Kim 等人，2003年;Mellroth 等，2003）3） 作为噬菌素诱导凝集或细胞的吞噬功能（Coteur等, 2007年；分株等，2002）在节肢动物和哺乳动物相比，对软体动物PGRPs的研究仍处于开端虽然 几个PGRP基因已被克隆太平洋牡蛎（伊藤和高桥，2008, 2009）,但其确切 的功能仍然没有得到很好的澄清在我们以前的研究中，出自直孔栉孔扇贝和信 使核糖核酸表达谱，鳗弧菌和微球菌挑战之后的短PGRP,栉孔扇贝及其mRNA 表达谱直孔后，鳗弧菌和微球菌lysodeikticus挑战，表明这是一个基本的和可 诱导的急性期蛋白对细菌感染的免疫反应（Su等人涉及一个短PGRP（CfPGRP- S1）, 2007）。

在本研究中，编码CfPGRP- S1的成熟肽的cDNA片段被重组重 组，并在大肠杆菌中被表达，对在先天免疫系统的包括PAMPS识别和结合能力、 凝集活性、酰化酶活性和杀菌活性的CfPGRP S1活动的功能重组进行了检查， 达到了更好地了解扇贝免疫防御机制的目的2、材料和方法2.1、扇贝的免疫刺激从中国山东省青岛市的一个农场收集了三栉孔扇贝平均壳长为55mm的成年人，在加工 前的一个星期保存在15°C的充气海水里两百扇贝被用于PAMPS刺激实验扇贝被 随机分为五组，每组40个一组接受了50 L磷酸盐缓冲液的注入（PBS, 0.14M 氯化钠，氯化钾3MM, 8MM二钠磷酸氢十二水合，1.5MM磷酸二氢钾，pH值 7.4）,来自大肠杆菌0111： B的脂多糖4（西格玛欽揂ldrich0.5mgml鈭n PBS）， 来自葡萄球菌的PGN未经处理的那组被定为空白组处理后，扇贝被送回水箱， 五个在注射3、6、12、24和48小时后被随机抽样血淋巴被收集起来，用离心 机分为500x G，每10分钟4Q来收获RNA制备的血细胞2・2、CfPGRP- S1- PAMPS刺激表达模式用Trizol试剂根据制造商的协议（Invitrogen公司）来提取总RNA。

第一 链合成进行了基于Promega公司的M - MLV RT用法信息使用我的DNA酶 （Promega公司）处理的总RNA为模板和寡（DT）适配器为引物（表1）合 成反应均在1小时后为42Q, 5分钟后达到95Q，加热终止基因混合稀释至1:100, 并存储在80«的后续SYBR绿色荧光实时定量RT - PCR技术中一对 CfPGRP- S1 CfPGRP- S1 RTF 和 CfPGRP- S1 RTR （见表 1）的基因 特异性引物，是用来放大从CDNA270 bp的产品，而PCR产物被按照顺序来验 证RT- PCR技术的特异性双肌动蛋白引物，AF和AR （见表1），用于扩增94 bp的片段，作为内部控制以验证成功的转录和校准相应的扇贝样本的cDNA模 板在ABI7300实时热循环仪里根据手册（Applied Biosystems公司）进行实时 RT - PCR扩增扩增产物的分离曲线分析在每个PCR的末端执行来确认只有 一个PCR产物扩增和检测°PCR程序后，使用ABI7300 SDS软件V2.0（Applied Biosystems公司）进行了数据分析为了保持一致性，基线通过软件自动设置。

2鈭CT方法用于分析CfPGRP- S1“ （Livak和Schmittgen, 2001）的表达水平 所有数据均在平均值土 SE （n=4）表示的相对表达数据双尾t检验未成之后遭 到单向方差分析（onewayANOVA）差异为P <0.05被认为是显著和为P <0.01 被认为是极显著2・3、CfPGRP- S1的重组表达CfPGRP- S1编码成熟肽的cDNA片段特异引物REF和RER （见表1） 一 起扩增一个BamH I位置被添加到引物REF的末端，在终止密码子后一个非 BamH I位置别添加到引物RER的末端PCR片段克隆到PMD18- T的简单载 体（TaKaRa），并通过限制性内切酶完全消化BamH I和非I （NEB），然后克隆 到的BamH I /非 I的表达载体pET - 32a（Novagen公司）的网站重组质粒（PET -32A - CfPGRP- S1）被转化进大肠杆菌 BL21 （DE3） pLysS 中（Novagen 公 司）阳性克隆被通过带有引物REF和RER的PCR筛选，并经过更深入的核 酸序列进一步得到证实没有插入片段的PET- 32A载体（Novagen公司），被 选定为阴性对照，可以表达硫氧还蛋白（事务处理）6x他在原核表达系统的标 签。

在LB培养基中培养阳性转化（含50mgml-1氨苄青霉素）在37晃动在220转C当培养基达到OD600值0.5-0.7,细胞再孵育4小时以达终浓度为Immol L -1 IPTG的诱导一个Ni2 +的螯合琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白CfPGRP- S1和 TRX （指定rCfPGRP- S1 和 订rx）,变性条件下400mmoll-1咪唑洗脱汇集（8 mol・L - 1的尿素）纯化后的蛋白在梯度尿素 TBS甘油缓冲里再被折起（50mmoll- 1 的 Tris - HCl, 50mmoll- 1 氯化钠,10%甘油，2mmoll- 1 还原型谷 胱甘肽，0.2mmoll- 1氧化谷胱甘肽，有6梯度尿素浓度，54, 3, 2, 1, 0mol L - 1尿素在每个梯度，pH值8.0;每个梯度在4 hoC为12）由此产生的蛋白质通过减 少15%SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来分离，可与古玛西中湖蓝 R250形象化用BCA方法（Smith等，1985）对纯化rCfPGRP- S1和订rx浓 度进行了量化，然后获得蛋白质保存于-80彗星之前使用2・4、抗体的预备和免疫印迹分析复性rCfPGRP- S1是继续对ddH20透析前的蛋白质被冻结集中°rCfPGRP- S1蛋白（NEB）通过肠消化来从融合蛋白中去除TRX标签，根据以前的报告程 等，蛋白质rCfPGRP- S1 （不包括trx标签）被免疫至6个星期的老年大鼠获得 多克隆抗体（2。