2022年几丁质酶基因的克隆和在伯克氏菌中的表达.docx

精品学习资源〔中国生物防治， 2006 年, 22（增）： 72-77〕芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌 B418 中的表达黄玉杰 1 杨合同 12 周红姿 1 李纪顺 1 吴远征 1 扈进冬 11 山东省科学院中日友好生物技术争论中心，山东省应用微生物重点试验室，济南 250014；2 山东理工高校生命科学学院， 淄博 255049摘要 采纳 PCR 技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列；片段共2227bp，含有一个具有 1788 个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于211bp，终止密码子位于 1998bp，共编码氨基酸 605 个；序列比较发觉同已发表的 Bacillus subtilis 几丁质酶核苷酸具有 99.39%的同源性；将该基因与大肠杆菌－伯克氏菌穿梭质粒 pRK415 连接，获得重组质粒 pRChi113；重组质粒电击转入伯克氏菌 B418 中，获得工程菌株 B418-9、B418-13；与野生菌株相比，平板 拮 抗 实 验 表 明， 工 程菌 株 对 Verticillum dahliae 、 Rhizoctonia solani 、Helminthosporium sativum、Rhizoctonia cerealis抑菌成效明显提高；关键词 几丁质酶 克隆 转化 伯克氏菌几丁质酶（ EC3.2.1.14）是催化降解几丁质的一类糖基水解酶，它可将由 β-1,4-N-乙酰 -D- 葡聚糖（ NAG ）残基组成的几丁质降解为低分子量的 NAG [1] ；几丁质酶广泛存在于有机物中，这些有机物本身可能不产生几丁质，例如细菌、真菌、昆虫、高等植物（ PR 蛋白）和动物等，对防治病原真菌具有重要的作用；顾真荣 [2] 曾报道三种产几丁质酶的芽孢杆菌（短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）对病原菌的抑菌作用；本试验室从小麦根际土壤中分别到了具有几丁质酶活性的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Ap113；通过设计引物获得几丁质酶编码基因，并进行序列分析，并将该基因利用电击方法导入到具有固氮、解磷、解钾，促进植物生长作用伯克氏菌 B418 中，以提高该菌的生防成效，为生产高产几丁质酶工程菌株奠定基础；1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 见表 1表 1 细菌菌株和质粒Table 1 Bacterial strains and plasmidsStrains/Plasmids Characteristics SourceB.subtilis Ap113 具有几丁质酶活性 Store in this labBurkholderia B418 具有解磷、解钾、促进植物生长作用 Store in this lab欢迎下载精品学习资源E.coli DH5α EndA1,hsdR17， thi-1,relA1,gyrA,recA1,△ 80LacZM15，△（ LacZYA-argF） U169rpMD18-T AmprStore in this lab购自 Takara欢迎下载精品学习资源rpMChi113 Amp，携带几丁质酶基因 本室连接重组获得pMSDChi113 Amp，携带几丁质酶基因，并在几丁质酶基因前具有 SD序列 本室连接重组获得rrpRK415 Amp， Tet 中国农业高校张力群惠赠作者简介：黄玉杰（ 1977－），女，硕士，助研；通讯作者 ,电子信箱 :yanght@基金工程：山东省优秀中青年科学家科研嘉奖基金工程（ 2004BS06007 ）欢迎下载精品学习资源pRChi113 带有几丁质酶基因片段 本室连接重组获得1.1.2 培育基B418 固体培育基 〔g/L〕 ： K2HPO4 0.5 ， MgSO4 7H2O 0.2 ， NaCl 0.02 ， CaCl20.2 ， NaMoO42H2O 0.002 ，乙二胺四乙酸铁钠盐 0.066, 谷氨酸钠 0.05, 葡萄糖5, 琼脂 15,pH 7.2-7.4B418 液体培育基 〔g/L〕: 胰蛋白胨 10, 酵母浸出物 1, CaCl 2 0.2 ，pH 7.2-7.4[3][4]大肠杆菌培育基 LB、SOC见参考文献几丁质培育基见参考文献1.1.3 酶和试剂各种限制性内切酶、 T4DNA ligase 等分别购自上海生工、 TaKaRa Biotech 公司， DNA 凝胶回收试剂盒购自 TaKaRa Biotech 公司， DNA 片段回收试剂盒购自上海生工； X-gal、IPTG 购自 TaKaRa Biotech公司；1.2 方法1.2.1 几丁质酶酶活性测定：见文献 [5]1.2.2 染色体 DNA的提取与纯化：参照《精编分子生物学试验指南》，并做肯定的修改1.2.3 几丁质酶编码基因引物的设计及 PCR：依据 GeneBank 上有关芽孢杆菌几丁质酶编码基因的碱基次序，采纳软件 Primer Premier 设计引物， PCR 反应条件及反应程序参照《精编分子生物学试验指南》 [3] 进行，其中 55℃复性60sec，共 35 个循环；扩增反应完成后， 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果；Chi113up:5 ’- CCACATACGGTTTGAAGAGGCG -3 ’Chi113do:5 ’- CGACTCTGCGGAAATGTTGTGG -3 ’1.2.4 PCR 产物的克隆及序列分析：将 PCR产物纯化，依据 pMD18-T 载体试剂盒的要求，将 PCR 产物与该载体连接，得到重组质粒 pMChi113 按 TSS 致敏缓冲液法转化 E.coli DH5 α，经酶切鉴定及酶活性检测确认后，序列测定；1.2.5 穿梭载体的构建及转化依据测序结果重新设计引物，在几丁质酶基因上游加上核糖体结合位点， chiSDup: 5 ’AG–GAGGTTGATATGAAAAAAGTGTTTTCA- 3’和 chiEcoRIdo: 5’- CGGAATTCTTATTTGCAATCACCAATT-3 ’，PCR 反应为 94℃预变性 5min，其次 94℃变性 1min，39℃退火 1.5min ，72℃延长 2min，共 10 个循环，然后94℃变性 1min， 41℃退火 1.5min ， 72℃延长 2min，共 25 个循环，最终 72℃延长 20min；将得到的 PCR产物同 pMD18-T 载体连接，转化，得到质粒pMSDChi113；同时设计 chiEcoRIup:5’-CGGAATTCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG 和chiEcoRIdo 进行 PCR扩增，反应条件同上；利用 EcoRI 酶切 PCR 产物，同EcoRI 酶切并去磷酸化的穿梭质粒 pRK415 连接，转化 E.coliDH5α，经 PCR 和酶切检测确认后，获得重组载体 pRChi113，电击转入伯克氏菌 B418 中，得到的转化子进行 PCR 扩增检测，并将长出的转化子转移至几丁质平板， 28℃培育3-5d，挑取能产生水解圈的菌落，利用 EcoRI 和 PstI 进行分别酶切检测目的片段及其连接方向，确定重组伯克氏菌 B418-9，B418-13；1.2.6 伯克氏菌 B418 与工程菌株 B418-15 的室内拮抗成效比较欢迎下载精品学习资源各种病原菌在 PDA 培育基上培育三天后，用灭菌打孔器取带菌丝的圆盘型 培育基块，将培育基块放在 PDA 平板的中心， B418、B418-9、B418-13 分别点接在距中心 2.5cm 的四周，同时以不加生防菌的平板做对比， 28℃下培育 96h 后测量抑菌带宽度；抑制率 =1-〔接细菌处病原菌扩展半径／对比病原菌扩展半径〕×100％；2 结果与分析2.1 几丁质酶基因的克隆2.1.1 PCR及与 T-载体的连接、转化和挑选依据 GenBank上有关芽孢杆菌几丁质酶基因序列，设计引物， PCR扩增， 产物的大小在 1.8kb 左右（图 1）；M 1 2 3 4 M 1 2欢迎下载精品学习资源1882bp图 1 几丁质酶基因的 PCR扩增Fig.1 PCR amplification of chitinase genes from B.subtilis M:Mark；Lane1,2,3:PCR 产物； lane4:Ap113 基因组 DNA10kb2kb 1kb图 3 重组质粒 pRChi113 的酶切检测Fig.3 Identification of plasmid pRChi113 by enzyme digestionM:Mark；Lane1: pRChi113 经 PstI 酶切产生 1kb 的条带； Lane2: pRChi113 经 EcoRI 酶切产生 1.7kb 的条带欢迎下载精品学习资源PCR产物与 pMD18-T连接，转化 E.coli DH5α ，37℃培育过夜，蓝白斑挑选到菌株 23 株，挑取一白斑，提质粒并测序，该质粒命名为 pMChi113；2.1.2 几丁质酶基因的序列测定和序列分析含有重组质粒 pMChi113的转化子送上海生工生物工程技术服务有限公司有限公司进行测序，测序结果如下1 TGCTCCCGGCCGCCATGGTGGCCGCGGGAATTCGATTCCACATACGGTTTGAAGAGGCGTATGAAAACCAAAAATGTAAGC82 GTTTTCCCCTTGTTGTCTTCAGTGTCATCAGCTGCTATGTCAGGACAAGGTGAATATAAACCTATTGAAAAGGGGGTGAAC163 AAAATAGAGTTTCATTGATGAACAGCCAAAAAAATTGATGAAAAGGAGATGAAAAAAGTGTTTTCAAACAAAAAGTTTCTC M K K V F S N K K F L244 GTTTTTTCTTTCATTTTTGCGATGATTTTAAGTCTGTCTTTTTTTAATGGGGAAAGTGCACAAGCCAGTTCTGACAAAAGTV F S F I F A M I L S L S F F N G E S A Q A S S D K S325 TATAAAATCATCGGCTACTATCCGTCCTGGGGCGCTTATGGAAGGGATTTTCAAGTATGGGATATGGATGCTTCTAAAGTC Y K I I G Y Y P S W G A Y G R D F Q V W D M D A S K V406 AGCCATATTAATTATGCATTTGCTGATATTTGCTGGGAGGGGAGGCATGGAAACCCTGATCCGACAGGCCCGAATCCCCAG S H I N Y A F A D I C W E G R H G N P D P T G P N P Q487 ACATGGTCTTGCCAGGATGAAAACGGAGTGATTGATGTTCCAAATGGATCAATCGTTATGGGGGACCCATGGATCGATGTGT W S C Q D E N G V I D V P N G S I V M G D P W I D V568 CAAAAGTCAAATGCCGGAGATACTTGGGATGAGCCGATTCGGGGCAACTTTAAACAACTATTGAAGCTGAAAAAGAACCAT Q。