基因工程的重组连接.ppt

基因工程的重组连接 ——DNA连接酶DNADNA连接酶连接酶概念：概念：DNADNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将反应形式是将DNADNA双链上相邻的双链上相邻的3 ’3 ’羟基和羟基和5’5’磷酸基团磷酸基团共价形成共价形成3 ’ -5’3 ’ -5’磷酸二酯键，使断开的磷酸二酯键，使断开的DNADNA切口连接切口连接起来，因此它在起来，因此它在DNADNA复制、修复以及体内体外的重组过复制、修复以及体内体外的重组过程中起重要作用程中起重要作用分类：分类：1. 1.E.coliE.coli DNA DNA ligaseligase: :需要烟酰胺腺嘌呤（需要烟酰胺腺嘌呤（NADNAD+ +））作辅助因作辅助因子，子， NADNAD+ + + +酶酶酶酶-AMP-AMP，，同时释放出同时释放出烟酰胺单核烟酰胺单核苷酸（苷酸（MMNMMN）） 活化的酶复合物在活化的酶复合物在DNADNA切口处修复磷切口处修复磷酸二酯键，并释放酸二酯键，并释放AMPAMP。

2.2.T T4 4 DNA DNA ligaseligase：由：由T4T4噬菌体基因编码，分子量约为噬菌体基因编码，分子量约为60KDa60KDa其活性以其活性以ATPATP为辅助因子，它与酶形成复合物，为辅助因子，它与酶形成复合物，并释放磷酸焦磷酸基团并释放磷酸焦磷酸基团DNADNA连接酶连接酶目前基因工程所使用的目前基因工程所使用的DNADNA连接酶多是来源于连接酶多是来源于T4T4噬菌体噬菌体的的T4DNAT4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌连接酶，因为它与大肠杆菌DNADNA连接酶相比，连接酶相比，具有以下特点：具有以下特点：1. 1.修复双链修复双链DNADNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种上的单链缺口（二者均相同），这是两种DNADNA连接酶的基本特征；连接酶的基本特征；2.2.连接连接DNA-RNADNA-RNA杂交双链上的杂交双链上的DNADNA或或RNARNA缺口，其中后缺口，其中后者反应速度较慢；者反应速度较慢；3.3.连接完全断开的连接完全断开的2 2个平头双链个平头双链DNADNA分子，反应速度通常分子，反应速度通常是粘头连接的是粘头连接的1/10-1/1001/10-1/100，因此这种反应属于分子间连接，，因此这种反应属于分子间连接，反应速度依赖于反应速度依赖于2 2个个DNADNA分子与酶之间的随机碰撞，所分子与酶之间的随机碰撞，所以速度较慢。

但是若适当提高酶量以及底物浓度，或在以速度较慢但是若适当提高酶量以及底物浓度，或在反应体系中加入适量的一价阳离子（如反应体系中加入适量的一价阳离子（如150-200mM 150-200mM NaClNaCl) )和低浓度和低浓度PEGPEG可以明显改善平头可以明显改善平头DNADNA分子的连接分子的连接DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNADNADNA连接反应的影响因素连接反应的影响因素连接反应的影响因素连接反应的影响因素1. 1. 1. 1.酶活单位：酶活单位：酶活单位：酶活单位：1 1 1 1国际单位（国际单位（国际单位（国际单位（U U U U）的）的）的）的T T T T4 4 4 4-DNAligase -DNAligase -DNAligase -DNAligase 的定义为：在的定义为：在的定义为：在的定义为：在最佳缓冲系统及最佳缓冲系统及最佳缓冲系统及最佳缓冲系统及15151515℃℃℃℃，，，，1h1h1h1h内完全连接内完全连接内完全连接内完全连接1μgλ-DNA1μgλ-DNA1μgλ-DNA1μgλ-DNA的的的的HindⅢHindⅢHindⅢHindⅢ片断所需的酶量。

片断所需的酶量片断所需的酶量片断所需的酶量2. 2. 2. 2. T T T T4 4 4 4-DNAligase-DNAligase-DNAligase-DNAligase的缓冲条件：的缓冲条件：的缓冲条件：的缓冲条件： 50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/L MgCl 10mmol/L MgCl 10mmol/L MgCl 10mmol/L MgCl2 2 2 2 5mmol/L DTT5mmol/L DTT5mmol/L DTT5mmol/L DTT    1mmol/L ATP1mmol/L ATP1mmol/L ATP1mmol/L ATP一般连接反应的总体系控制在一般连接反应的总体系控制在一般连接反应的总体系控制在一般连接反应的总体系控制在10-15ul10-15ul10-15ul10-15ul内。

同样内同样T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA连接连接连接连接酶储藏于酶储藏于酶储藏于酶储藏于50%50%50%50%的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑制因此酶的总用量也不要超过总体系的制因此酶的总用量也不要超过总体系的制因此酶的总用量也不要超过总体系的制因此酶的总用量也不要超过总体系的1/101/101/101/10DNADNA连接酶连接酶3.3.3.3.影响影响影响影响T4DNAT4DNAT4DNAT4DNA连接酶连接反应的因素：连接酶连接反应的因素：连接酶连接反应的因素：连接酶连接反应的因素：a. a.a. a.温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的TmTmTmTm为为为为15151515℃℃℃℃，另一方面，另一方面，另一方面，另一方面T4DNAT4DNAT4DNAT4DNA连接酶本身最合适的反应温度为连接酶本身最合适的反应温度为连接酶本身最合适的反应温度为连接酶本身最合适的反应温度为37℃37℃37℃37℃，，，，5℃5℃5℃5℃以下活性大大下降。

因此在实际操作中，我以下活性大大下降因此在实际操作中，我以下活性大大下降因此在实际操作中，我以下活性大大下降因此在实际操作中，我们多采用过夜们多采用过夜们多采用过夜们多采用过夜15℃-16℃15℃-16℃15℃-16℃15℃-16℃连接；连接；连接；连接；b.b.b.b.离子浓度：过高或过低的离子浓度离子浓度：过高或过低的离子浓度离子浓度：过高或过低的离子浓度离子浓度：过高或过低的离子浓度会会会会影响反应速度；影响反应速度；影响反应速度；影响反应速度；c. c. c. c.DNADNADNADNA片段：片段：片段：片段：I. I. I. I.DNADNADNADNA末端的性质末端的性质末端的性质末端的性质 如果为粘性末端可以看作分子内的连如果为粘性末端可以看作分子内的连如果为粘性末端可以看作分子内的连如果为粘性末端可以看作分子内的连接反应；但如果为平头接反应；但如果为平头接反应；但如果为平头接反应；但如果为平头DNADNADNADNA分子之间连接，则是分子间分子之间连接，则是分子间分子之间连接，则是分子间分子之间连接，则是分子间连接，速度大大下降；连接，速度大大下降；连接，速度大大下降；连接，速度大大下降；II.II.II.II.DNADNADNADNA浓度、浓度、浓度、浓度、DNADNADNADNA片段的大小片段的大小片段的大小片段的大小 分子内连接：片段与载体的摩尔数比分子内连接：片段与载体的摩尔数比分子内连接：片段与载体的摩尔数比分子内连接：片段与载体的摩尔数比=2=2=2=2：：：：1 1 1 1——3 3 3 3：：：：1 1 1 1 分子间连接：分子间连接：分子间连接：分子间连接：51.1/(DNA51.1/(DNA51.1/(DNA51.1/(DNA浓度：浓度：浓度：浓度：g/L)g/L)g/L)g/L)   ( ( ( (分子量：分子量：分子量：分子量：daltondaltondaltondalton) ) ) )的值如果小于的值如果小于的值如果小于的值如果小于1 1 1 1则容易发生分子间的连接反应则容易发生分子间的连接反应则容易发生分子间的连接反应则容易发生分子间的连接反应一般性规律是：一般性规律是：一般性规律是：一般性规律是：DNADNADNADNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应浓度越稀越容易发生分子内连接反应浓度越稀越容易发生分子内连接反应浓度越稀越容易发生分子内连接反应。

DNADNA连接酶连接酶4.4.普通连接反应的设计：普通连接反应的设计：普通连接反应的设计：普通连接反应的设计：总体系总体系 10ul10ul1010×buffer 1ul×buffer 1ulVector (3k;500ng/ul) 1ulVector (3k;500ng/ul) 1ulDNA fragment(500bp;50ng/ul) 3-5ulDNA fragment(500bp;50ng/ul) 3-5ulLigaseLigase 0.5-1ul 0.5-1ulHH2 2OO 加水至加水至10ul10ulDNADNA连接酶连接酶重组率及其影响因素：重组率及其影响因素：重组率及其影响因素：重组率及其影响因素：1. 1. 1. 1.重组率：是指连接反应结束后，含有外源重组率：是指连接反应结束后，含有外源重组率：是指连接反应结束后，含有外源重组率：是指连接反应结束后，含有外源DNADNADNADNA片段的重组分子与所片段的重组分子与所片段的重组分子与所片段的重组分子与所投入的载体分子数之比；投入的载体分子数之比；投入的载体分子数之比；投入的载体分子数之比；2.2.2.2.重组率与连接效率的关系：重组率与连接效率的关系：重组率与连接效率的关系：重组率与连接效率的关系：a. a.a. a.一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）；一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）；一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）；一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）；b.b.b.b.如果外源如果外源如果外源如果外源DNADNADNADNA片段与载体片段与载体片段与载体片段与载体DNADNADNADNA分子均是经过一种限制性内切酶处分子均是经过一种限制性内切酶处分子均是经过一种限制性内切酶处分子均是经过一种限制性内切酶处理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了。

因此理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了因此理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了因此理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了因此在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或空载此时的连接效率就高于重组效率因此有些措施能够提高连空载此时的连接效率就高于重组效率因此有些措施能够提高连空载此时的连接效率就高于重组效率因此有些措施能够提高连空载此时的连接效率就高于重组效率因此有些措施能够提高连接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长反应时间等；反应时间等；反应时间等；反应时间等；c. c. c. c.如何提高重组率：如何提高重组率：如何提高重组率：如何提高重组率：I. I. I. I.提高外源提高外源提高外源提高外源DNADNADNADNA片段和载体片段和载体片段和载体片段和载体DNADNADNADNA分子之比（分子之比（分子之比（分子之比（2-102-102-102-10：：：：1 1 1 1 ）））） ，这样就可以，这样就可以，这样就可以，这样就可以增加外源增加外源增加外源增加外源DNADNADNADNA片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间以及载体以及载体以及载体以及载体DNADNADNADNA两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；DNADNA连接酶连接酶II.II.II.II.在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体DNADNADNADNA，，，，去除其去除其去除其去除其5’5’5’5’端的磷酸基团，这样即使端的磷酸基团，这样即使端的磷酸基团，这样即使端的磷酸基团，这样即使DNADNADNADNA载体分子的两个粘载体分子的两个粘载体分子的两个粘载体分子的两个粘性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；III.III.III.III.在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdTTdTTdT) ) ) )在在在在载体分子的载体分子的载体分子的载体分子的3 3 3 3 ’’羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源DNADNADNADNA片段的片段的片段的片段的3’3’3’3’端加上与之互补的寡核苷酸，二者退端加上与之互补的寡核苷酸，二者退端加上与之互补的寡核苷酸，二者退端加上与之互补的寡核苷酸，二者退火后再连接火后再连接火后再连接火后再连接。

无反应无反应DNADNA连接酶连接酶DNADNADNADNA分子重组的方法：分子重组的方法：分子重组的方法：分子重组的方法：1. 1. 1. 1.相同的粘性末端的连接：如果外源相同的粘性末端的连接：如果外源相同的粘性末端的连接：如果外源相同的粘性末端的连接：如果外源DNADNADNADNA分子与分子与分子与分子与DNADNADNADNA载体均使用相载体均使用相载体均使用相载体均使用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个重组分子重组分子重组分子重组分子a. a.a. a.相同的双酶酶切：定向克隆相同的双酶酶切：定向克隆相同的双酶酶切：定向克隆相同的双酶酶切：定向克隆b.b.b.b.单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入。

但单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入但单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入但单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入但无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段DNADNADNADNA和载体和载体和载体和载体DNADNADNADNA切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；c. c. c. c.用两种同尾酶分别切割用两种同尾酶分别切割用两种同尾酶分别切割用两种同尾酶分别切割DNADNADNADNA片段和载体片段和载体片段和载体片段和载体DNADNADNADNA（如（如（如（如DNADNADNADNA建库中，建库中，建库中，建库中，Sau3AISau3AISau3AISau3AI酶切外源酶切外源酶切外源酶切外源DNADNADNADNA，，，，而而而而   -phage-phage-phage-phage载体用载体用载体用载体用BamHIBamHIBamHIBamHI处理），其实产生处理），其实产生处理），其实产生处理），其实产生了了了了4 4 4 4个相同个相同个相同个相同 的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶切口称为切口称为切口称为切口称为““““焊死焊死焊死焊死””””作用。

当然少数情况下产生的连接重组分子可以作用当然少数情况下产生的连接重组分子可以作用当然少数情况下产生的连接重组分子可以作用当然少数情况下产生的连接重组分子可以被一种酶切开（如可以被被一种酶切开（如可以被被一种酶切开（如可以被被一种酶切开（如可以被Sau3ASau3ASau3ASau3A切开）DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶平头末端的连接：平头末端的连接：平头末端的连接：平头末端的连接：T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA连接酶既可以连接粘性末端，也能连接酶既可以连接粘性末端，也能连接酶既可以连接粘性末端，也能连接酶既可以连接粘性末端，也能DNADNADNADNA平头末端的连接前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因平头末端的连接前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因平头末端的连接前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因平头末端的连接前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只有前者速度的有前者速度的有前者速度的有前者速度的1/10-1/1001/10-1/1001/10-1/1001/10-1/100。

因此，如何提高平头连接速度，包括：因此，如何提高平头连接速度，包括：因此，如何提高平头连接速度，包括：因此，如何提高平头连接速度，包括：1. 1. 1. 1.增加连接酶的用量，但这种操作在实际上很难实现，因为体系中酶增加连接酶的用量，但这种操作在实际上很难实现，因为体系中酶增加连接酶的用量，但这种操作在实际上很难实现，因为体系中酶增加连接酶的用量，但这种操作在实际上很难实现，因为体系中酶量的增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；量的增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；量的增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；量的增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；2.2.2.2.增加平头末端的浓度，从而提高分子之间相互碰撞的机会；增加平头末端的浓度，从而提高分子之间相互碰撞的机会；增加平头末端的浓度，从而提高分子之间相互碰撞的机会；增加平头末端的浓度，从而提高分子之间相互碰撞的机会；3.3.3.3.加入一定量的加入一定量的加入一定量的加入一定量的NaClNaClNaClNaCl( ( ( (或或或或LiClLiClLiClLiCl））））以及以及以及以及PEGPEGPEGPEG（（（（终浓度终浓度终浓度终浓度   1%1%1%1%）；）；）；）；4.4.4.4.适当提高反应温度。

因为平头末端连接不存在分子末端退火的问题，适当提高反应温度因为平头末端连接不存在分子末端退火的问题，适当提高反应温度因为平头末端连接不存在分子末端退火的问题，适当提高反应温度因为平头末端连接不存在分子末端退火的问题，因此提高温度，不仅可以增强连接酶的活性，还有利于提高分子之因此提高温度，不仅可以增强连接酶的活性，还有利于提高分子之因此提高温度，不仅可以增强连接酶的活性，还有利于提高分子之因此提高温度，不仅可以增强连接酶的活性，还有利于提高分子之间的碰撞机会反应温度在平头连接中多采用间的碰撞机会反应温度在平头连接中多采用间的碰撞机会反应温度在平头连接中多采用间的碰撞机会反应温度在平头连接中多采用20202020℃℃℃℃-25-25-25-25℃℃℃℃；；；；5.5.5.5.体系中高浓度体系中高浓度体系中高浓度体系中高浓度ATPATPATPATP为平头末端连接的不利因素为平头末端连接的不利因素为平头末端连接的不利因素为平头末端连接的不利因素ATPATPATPATP浓度浓度浓度浓度   1mmol/L1mmol/L1mmol/L1mmol/L会发生会发生会发生会发生A A A A在连接位点的随即插入；在连接位点的随即插入；在连接位点的随即插入；在连接位点的随即插入； ATPATPATPATP浓度浓度浓度浓度   2.5mmol/L2.5mmol/L2.5mmol/L2.5mmol/L，，，，会直接抑会直接抑会直接抑会直接抑制平头末端连接反应。

因此对大多数反应来说制平头末端连接反应因此对大多数反应来说制平头末端连接反应因此对大多数反应来说制平头末端连接反应因此对大多数反应来说ATPATPATPATP浓度浓度浓度浓度   0.5mmol/L0.5mmol/L0.5mmol/L0.5mmol/L是比较合适的；是比较合适的；是比较合适的；是比较合适的；6.6.6.6.对于平头末端的连接效率：对于平头末端的连接效率：对于平头末端的连接效率：对于平头末端的连接效率：HacIIIHacIIIHacIIIHacIII     AlaIAlaIAlaIAlaI     HacIIHacIIHacIIHacII     SmaISmaISmaISmaIDNADNA连接酶连接酶不同粘性末端的连接：不同的粘性末端在原则上无法直不同粘性末端的连接：不同的粘性末端在原则上无法直接连接，但是可以将它们转化位平头末端后再进行连接接连接，但是可以将它们转化位平头末端后再进行连接1. 1.待连接的两种待连接的两种DNADNA分子具有分子具有5’5’突出末端：两种分子突出末端：两种分子 均均用用KlenowKlenow酶补平，或用酶补平，或用S1S1核苷酸酶切平，然后变成平端核苷酸酶切平，然后变成平端连接。

一般用连接一般用KlenowKlenow酶补平多见而酶补平多见而S1S1核苷酸酶不好掌核苷酸酶不好掌握，容易造成双链握，容易造成双链DNADNA的降解反应；的降解反应；2.2.待连接的两种待连接的两种DNADNA分子均具有分子均具有3’3’突出末端：突出末端：T4 DNAT4 DNA聚聚合酶可以将这两种合酶可以将这两种DNADNA的的3’3’突出末端切除，形成平头突出末端切除，形成平头后再连接，所产生重组分子减少了碱基对；后再连接，所产生重组分子减少了碱基对；3.3.一种一种DNADNA分子具有突出的分子具有突出的3’3’末端，另一种具有末端，另一种具有5’5’突出突出末端：一般采用末端：一般采用T4 DNAT4 DNA聚合酶切除聚合酶切除3’3’突出末端；突出末端； 5’5’突出末端用突出末端用KlenowKlenow酶补平，再进行连接；酶补平，再进行连接；4.4.两种两种DNADNA分子分别含有不同的分子分别含有不同的2 2个粘性末端：每一种个粘性末端：每一种DNADNA分子均用分子均用T4 DNAT4 DNA聚合酶切平聚合酶切平3’3’突出端；用突出端；用KlenowKlenow酶补平酶补平5’5’突出端突出端DNADNA连接酶连接酶人工粘性末端连接：上述不同粘性末端的连接大多数破坏人工粘性末端连接：上述不同粘性末端的连接大多数破坏了原有的限制性内切酶识别序列，导致重组的外源了原有的限制性内切酶识别序列，导致重组的外源DNADNA片段不能回收，同时平末端连接效率低下。

为克服这些缺片段不能回收，同时平末端连接效率低下为克服这些缺点，可以用点，可以用TdTTdT处理经过酶切的处理经过酶切的DNADNA片段，使之在片段，使之在3’3’加加上同聚物尾，再进行连接上同聚物尾，再进行连接1. 1.5’5’突出末端突出末端：：DNA DNA DNA DNA KlenowKlenowKlenowKlenow酶补平酶补平酶补平酶补平 以以以以TdTTdTTdTTdT加上多聚加上多聚加上多聚加上多聚C C C C的人工粘性末端；的人工粘性末端；的人工粘性末端；的人工粘性末端； 退火退火退火退火再用再用再用再用KlenowKlenowKlenowKlenow填补缺刻填补缺刻填补缺刻填补缺刻载体载体载体载体 KlenowKlenowKlenowKlenow酶补平酶补平酶补平酶补平以以以以TdTTdTTdTTdT加上多聚加上多聚加上多聚加上多聚G G G G的人工粘性末端；的人工粘性末端；的人工粘性末端；的人工粘性末端；2.2.3’3’突出末端：直接用突出末端：直接用TdTTdT在在3’3’末端加上两种多聚物的人末端加上两种多聚物的人工粘性末端工粘性末端退火退火KlenowKlenow填补缺刻填补缺刻3.3.平头末端：直接使用平头末端：直接使用TdTTdT加上多聚物的人工粘性末端加上多聚物的人工粘性末端退退火连接火连接KlenowKlenow修补缺刻，但与前二者不同之处是不能修补缺刻，但与前二者不同之处是不能用原来的平口限制性内切酶切割。

用原来的平口限制性内切酶切割DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶酶切位点的定点变更：在有的分子克隆的实验中，需要将酶切位点的定点变更：在有的分子克隆的实验中，需要将DNADNA上的一上的一种限制性内切酶识别序列变成另一种酶的识别序列，以便种限制性内切酶识别序列变成另一种酶的识别序列，以便DNADNA分子重分子重组有两种方法可以达到该目的：组有两种方法可以达到该目的：1. 1.加装人工接头：接头是一段含有一种限制性内切酶识别序列的人工合成加装人工接头：接头是一段含有一种限制性内切酶识别序列的人工合成寡核苷酸，通常为寡核苷酸，通常为8-108-10聚体a.a.若若DNADNA分子为平头末端，直接加上人工的接头；分子为平头末端，直接加上人工的接头；b.b.DNADNA分子若为酶切后的粘端，则依照分子若为酶切后的粘端，则依照5’5’突出端用突出端用KlenowKlenow酶补平以及酶补平以及3’3’末端用末端用T4DNAT4DNA聚合酶切平的原则，把粘端变为平端，同时消除原有聚合酶切平的原则，把粘端变为平端，同时消除原有酶切位点，再加上人工的接头；酶切位点，再加上人工的接头；2.2.改造识别序列：用一种限制性内切酶的识别序列，改造另一种酶的识别改造识别序列：用一种限制性内切酶的识别序列，改造另一种酶的识别序列，使前者移到后者的位置上。

序列，使前者移到后者的位置上 如将如将AluAlu识别序列改造成为识别序列改造成为EcoRIEcoRI识别序列识别序列AluAlu切开切开切开切开DNADNA片段片段片段片段 DNADNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接2 2个片段个片段个片段个片段AluAlu转变为转变为转变为转变为EcoRIEcoRIEcoRIEcoRI 切开另一条切开另一条切开另一条切开另一条DNADNA片段片段片段片段KlenowKlenow酶补平粘性末端酶补平粘性末端酶补平粘性末端酶补平粘性末端 具体分析我们可以发现，其实只要具体分析我们可以发现，其实只要具体分析我们可以发现，其实只要具体分析我们可以发现，其实只要3’3’3’3’端提供端提供端提供端提供G G G G碱基的限制性内切酶识碱基的限制性内切酶识碱基的限制性内切酶识碱基的限制性内切酶识别序列，包括粘端经别序列，包括粘端经别序列，包括粘端经别序列，包括粘端经KlenwoKlenwoKlenwoKlenwo补平或补平或补平或补平或T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA聚合酶切平，均可以变成聚合酶切平，均可以变成聚合酶切平，均可以变成聚合酶切平，均可以变成EcoRIEcoRIEcoRIEcoRI识别序列。

识别序列识别序列识别序列DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶其它的工具酶其它的工具酶KlenowKlenow酶：大肠杆菌酶：大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的的NN端大片段；端大片段；1. 1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的活性：的活性：a.a.5’-3’DNA5’-3’DNA聚合酶活性聚合酶活性b.b.3’-5’3’-5’核酸外切酶活性核酸外切酶活性c. c.5’-3’5’-3’核酸外切酶活性核酸外切酶活性d.d.核酸内切酶活性核酸内切酶活性而而KlenowKlenow酶具有前两者的活性酶具有前两者的活性2.2.KlenowKlenow酶的用途：酶的用途：a.a.修复修复3’3’凹陷，使之成为平头；凹陷，使之成为平头；b.b.切口平移法标记杂交探针；切口平移法标记杂交探针；c. c.合成合成cDNAcDNA的第的第2 2条链其它的工具酶其它的工具酶DNADNA模板模板加热、变性加热、变性与与6 6核苷酸随机核苷酸随机引物退火引物退火KlenowKlenow 酶酶,T4-,T4-DNA DNA ligaseligase dNTP, 32P-dCTP杂交探针杂交探针其它的工具酶其它的工具酶TdTTdT（（末端脱氧核苷酸转移酶）：是一种不依赖于模末端脱氧核苷酸转移酶）：是一种不依赖于模板的板的DNADNA聚合酶，其合适的底物形式为聚合酶，其合适的底物形式为3’3’游离羟基游离羟基的双链的双链DNADNA。

1. 1. TdTTdT的活性特点：的活性特点：a.a.3’3’突出末端，突出末端， TdTTdT在在Mg2+Mg2+存在下可以将脱氧核苷酸存在下可以将脱氧核苷酸 dNTPdNTP随机加在双链随机加在双链DNA3’DNA3’末端；末端；b.b.3’3’为凹端或为平头时，需要为凹端或为平头时，需要Co2+Co2+激活，仍可以将激活，仍可以将dNTPdNTP加在加在3’3’末端，且不按照模板；末端，且不按照模板；2.2.TdTTdT的用途：在人工粘性末端构建中极为有用的用途：在人工粘性末端构建中极为有用其它的工具酶其它的工具酶其它的工具酶其它的工具酶碱性磷酸单酯酶：可以催化碱性磷酸单酯酶：可以催化DNADNA、、RNARNA的的5’5’末末端核苷酸去除端核苷酸去除P P基团，使基团，使5’5’成为成为-OH-OH碱性磷酸单酯酶的用途：碱性磷酸单酯酶的用途：1. 1.单酶切后载体用碱性磷酸单酯酶处理，可以防单酶切后载体用碱性磷酸单酯酶处理，可以防止载体自我环化；止载体自我环化；2.2.片段或者接头片段或者接头5’5’末端除去末端除去P P，，则可以防止则可以防止DNADNA片段之间的连接。

片段之间的连接其它的工具酶其它的工具酶其它的工具酶其它的工具酶T4 T4 多聚核苷酸激酶（多聚核苷酸激酶（T4 PNPT4 PNP）：将）：将ATPATP上的上的 -P-P转移到转移到单链单链DNADNA、、双链双链DNADNA或或RNARNA以及寡核苷酸以及寡核苷酸5’5’游离羟基游离羟基用途：用途：1. 1.用于用于DNADNA、、RNA5’RNA5’末端标记；末端标记；2.2.用于人工接头（用于人工接头（linker)linker)或衔接物或衔接物(adaptor(adaptor））5’5’末端磷酸末端磷酸化其它的工具酶其它的工具酶DNA linker:DNA adaptor: 3’-GGCTTAAGCCCCCC 3’-TTAAGCCCCCCHO- CGGGGGGHO-CCGAATTCGGGGGG其它的工具酶其它的工具酶T4-DNAT4-DNA聚合酶：聚合酶：聚合酶：聚合酶： 该酶不仅具有该酶不仅具有该酶不仅具有该酶不仅具有5 ’ -3’5 ’ -3’的的的的DNADNA聚聚聚聚合酶活性和合酶活性和合酶活性和合酶活性和5 ’-3 ’5 ’-3 ’的核酸外切酶活性，而且具有极的核酸外切酶活性，而且具有极的核酸外切酶活性，而且具有极的核酸外切酶活性，而且具有极强的强的强的强的3 ’-5 ’3 ’-5 ’核酸外切酶活性，后者对于单链核酸外切酶活性，后者对于单链核酸外切酶活性，后者对于单链核酸外切酶活性，后者对于单链DNADNA的作用很大。

的作用很大的作用很大的作用很大用途：用途：用途：用途：DNADNA末端的平滑化末端的平滑化末端的平滑化末端的平滑化。