第六、七章倍性育种、诱变育种pp时t课件.ppt

第六章第六章 倍性育种倍性育种染色体组染色体组（（Genome））单倍体（单倍体（Haploid））二倍体（二倍体（Diploid））多倍体（多倍体（Polyploid））菊属菊属Dendranthema2n=2x=18香叶菊香叶菊 D . aromaticum菊花脑菊花脑 D . nakingense2n=4x=36甘菊甘菊 D . lavandulaefolium野菊野菊 D . indicum2n=6x=54毛华菊毛华菊 D .vestitum紫花野菊紫花野菊 D . zawadskii2n=8x=72D . orantum(Hemsl) Kitam2n=10x=90矶菊矶菊 D . pacificum第一节第一节 多倍体育种多倍体育种选育细胞核中具有选育细胞核中具有 3 套以上染色套以上染色体的优良新品种体的优良新品种 园艺植物的多倍体现象园艺植物的多倍体现象2n=4x=40F．virginiana Duch 现代草莓主要是八倍体凤梨草莓（弗州草莓现代草莓主要是八倍体凤梨草莓（弗州草莓+智利草莓）智利草莓）被子植物中有被子植物中有1/3是多倍体是多倍体裸子植物的多倍体裸子植物的多倍体l裸子植物的染色体大而整齐，染色体基数的裸子植物的染色体大而整齐，染色体基数的变化也较小，变化也较小，x=11或或12，只有少数论是例外。

只有少数论是例外裸子植物的多倍体不普遍裸子植物的多倍体不普遍l松柏科中的多倍体只有三种：松柏科中的多倍体只有三种：             北美红杉北美红杉(6n)             泼非氏桧柏泼非氏桧柏(4n)             金钱松金钱松(4n，，44)果树植物的多倍体果树植物的多倍体l果树中的多倍体也很普遍如：草莓、香蕉、果树中的多倍体也很普遍如：草莓、香蕉、李子、樱桃、菠萝、柑桔、枣、葡萄、苹果、李子、樱桃、菠萝、柑桔、枣、葡萄、苹果、梨l目前全世界经过染色体鉴定的果树，包括目前全世界经过染色体鉴定的果树，包括36科，科，70属，属，800余种其中多倍体余种其中多倍体20科，科，35属，属，400余种园艺植物属内倍性系列园艺植物属内倍性系列属名属名基数（基数（x)2x3x4x5x6x7x8x苹果属苹果属1734516885－－－－－－柑橘属柑橘属918273645－－－－－－茄属茄属1224364860728496菊属菊属918273645546372一、多倍体的概念与类型一、多倍体的概念与类型 1 ．多倍体的概念．多倍体的概念 l在一个植物属内，以染色体数目最少的二倍体在一个植物属内，以染色体数目最少的二倍体种的配子染色体数为准，作为全属植物的染色种的配子染色体数为准，作为全属植物的染色体基数，包括这一基数的染色体称为一个染色体基数，包括这一基数的染色体称为一个染色体组，用体组，用 x 表示。

表示 l凡体细胞含有凡体细胞含有 3 套及套及 3 套以上染色体组的生物套以上染色体组的生物个体称之为个体称之为 多倍体（多倍体（ polyploid ）） 2 ．多倍体的类型．多倍体的类型 l同源多倍体：形成多倍体的染色体组来自同一物同源多倍体：形成多倍体的染色体组来自同一物种l异源多倍体：由两个或两个以上不同物种的染色异源多倍体：由两个或两个以上不同物种的染色体组组成体组组成l异数多倍体（非整数多倍体）：细胞中染色体的异数多倍体（非整数多倍体）：细胞中染色体的数目不为基数的整倍性数目不为基数的整倍性二、多倍体的特点二、多倍体的特点 1 ．巨大性．巨大性 l在体形和细胞上都表现出明显的巨大性：在体形和细胞上都表现出明显的巨大性：l叶片变宽增厚、茎粗壮；叶片变宽增厚、茎粗壮；l花、果实、种子增大；花、果实、种子增大；l气孔与花粉增大等气孔与花粉增大等夏腊梅夏腊梅(sinocalycanthus chinensis)二二倍倍体体与与四四倍倍体体的的花花和和气气孔孔比比较较2 ．其它形态及生理特征．其它形态及生理特征 l叶色浓绿，花色鲜艳；叶色浓绿，花色鲜艳；l生长缓慢，发育延迟；生长缓慢，发育延迟；l呼吸和蒸腾作用减弱，光合效率高；呼吸和蒸腾作用减弱，光合效率高；l适应性强。

适应性强 3 ．育性．育性 l同源多倍体表现很大程度的不育性；同源多倍体表现很大程度的不育性；l三倍体高度不育三倍体高度不育 l异数多倍体存在一定程度的不育异数多倍体存在一定程度的不育 l异源多倍体具有高度的可育性异源多倍体具有高度的可育性4 ．遗传变异性．遗传变异性 l遗传性比较丰富；遗传性比较丰富；l分离现象幅度加大；分离现象幅度加大；l变异范围广泛变异范围广泛 ；；                                    --尤其是异源多倍体尤其是异源多倍体大丽花花色基因控制大丽花花色基因控制Y基因基因黄色类黄酮黄色类黄酮I基因基因H基因基因A基因基因B基因基因花色素苷花色素苷少量少量大量大量大丽花花色遗传的一般规律大丽花花色遗传的一般规律影响花色的基因之间的关系（影响花色的基因之间的关系（19601960，巴利斯、汉尼、威尔逊），巴利斯、汉尼、威尔逊）W W 有色的有色的 ww ww 白色的白色的In In 非象牙白色非象牙白色 iviv iviv 象牙白色象牙白色Y Y 非黄色非黄色 yy yy 黄色黄色B B 紫红或黄紫色紫红或黄紫色 bb bb 蓝色蓝色P P 紫红或黄紫色紫红或黄紫色 pp pp 粉红、蔷薇色、红色粉红、蔷薇色、红色Did Did 使色彩加浓使色彩加浓 did did 使色彩变淡使色彩变淡上述六个基因的上下位关系是：上述六个基因的上下位关系是：W>In>Y>B>P>DidW>In>Y>B>P>Did。

三、多倍体育种的意义三、多倍体育种的意义 l多倍体具有花大、重瓣性强、花色浓艳、抗多倍体具有花大、重瓣性强、花色浓艳、抗逆性强等优点逆性强等优点 l多倍体在植物进化中起着重要作用：多倍体多倍体在植物进化中起着重要作用：多倍体在自然界普遍存在，被子植物中在自然界普遍存在，被子植物中 1/3以上为以上为多倍体 l多倍体是克服远缘杂交不亲和性及远缘杂种多倍体是克服远缘杂交不亲和性及远缘杂种难稔性的重要手段难稔性的重要手段小黑麦：小黑麦：异源八倍体异源八倍体（（AABBDDRR ，， 2n=56））抗逆性强，适应干冷气候，抗白粉病，蛋白质氨基酸含量抗逆性强，适应干冷气候，抗白粉病，蛋白质氨基酸含量高作为粮食和饲料，在高作为粮食和饲料，在50多个国家广泛栽培多个国家广泛栽培（很可惜（很可惜,萝卜甘蓝的根像甘蓝萝卜甘蓝的根像甘蓝,叶像萝卜叶像萝卜,没有经济价值没有经济价值但是但是,这却提供了种间或属间杂交在短期内这却提供了种间或属间杂交在短期内(只需两代只需两代)创造创造新种的方法新种的方法F1是高度不育是高度不育萝卜甘蓝四四 、多倍体形成的原理与途径、多倍体形成的原理与途径 l在自然条件下，温度的剧变，紫外线照射，在自然条件下，温度的剧变，紫外线照射，恶劣多变的气候条件是产生多倍体细胞的恶劣多变的气候条件是产生多倍体细胞的重要原因。

重要原因多倍体形成的主要途径多倍体形成的主要途径l1 ．无性阶段染色体加倍，即体细胞有丝．无性阶段染色体加倍，即体细胞有丝分裂过程中发生核内有丝分裂导致染色体分裂过程中发生核内有丝分裂导致染色体加倍（无性多倍化加倍（无性多倍化 ） l2 ．有性阶段染色体加倍，即小孢子母细．有性阶段染色体加倍，即小孢子母细胞或大孢子母细胞在减数分裂过程中不减胞或大孢子母细胞在减数分裂过程中不减数产生数产生 2n 配子（有性多倍化）配子（有性多倍化） 2n 配子形成的主要途经：配子形成的主要途经：l 1 ) 性母细胞减数分裂前染色体加倍；性母细胞减数分裂前染色体加倍；l 2 ) 减数分裂失败形成重组核；减数分裂失败形成重组核；l 3 ) 减数第一次分裂后，第二次分裂前染色体减数第一次分裂后，第二次分裂前染色体 DNA 复制；复制； l4 )减数第二次分裂时形成平行纺锤体或纺锤体融减数第二次分裂时形成平行纺锤体或纺锤体融合；合；l 5 ) 不正常的胞质分裂；不正常的胞质分裂；l 6 ) 减数分裂后染色体加倍；减数分裂后染色体加倍；l 7 ) 无孢子生殖无孢子生殖 五、五、 人工诱导多倍体的方法人工诱导多倍体的方法 l物理方法：温度剧变、机械损伤、射线物理方法：温度剧变、机械损伤、射线处理、高速离心处理、高速离心 l化学方法：化学方法：秋水仙素秋水仙素、细胞松弛素、细胞松弛素B、富、富民隆（对甲苯磺硫苯氨基苯汞）、萘嵌民隆（对甲苯磺硫苯氨基苯汞）、萘嵌戊烷、一些除草剂等戊烷、一些除草剂等 l生物方法：杂交、组织培养生物方法：杂交、组织培养 （胚乳培养）1 ．多倍体诱导材料的选择．多倍体诱导材料的选择 l选用综合性状优良，遗传基础好的材料选用综合性状优良，遗传基础好的材料 l选择染色体倍性较低，染色体数少的植物选择染色体倍性较低，染色体数少的植物 l选用异花授粉植物及杂种后代选用异花授粉植物及杂种后代 l选择可利用营养器官进行繁殖的植物选择可利用营养器官进行繁殖的植物 2 ．秋水仙素诱导多倍体的处理方法．秋水仙素诱导多倍体的处理方法 l秋水仙素的作用机理秋水仙素的作用机理 ：细胞分裂时，抑：细胞分裂时，抑制纺锤丝的形成，使正常分离的染色体制纺锤丝的形成，使正常分离的染色体不能拉向细胞的两极；同时抑制细胞板不能拉向细胞的两极；同时抑制细胞板的形成，从而导致加倍。

的形成，从而导致加倍l秋水仙素的处理方法秋水仙素的处理方法 ：： l1 ）浸渍法：处理种子、枝条等）浸渍法：处理种子、枝条等 l2 ）滴涂法：处理幼苗顶芽、植株侧芽的生长点）滴涂法：处理幼苗顶芽、植株侧芽的生长点 l3 ）注射法：将秋水仙素溶液注射到作用部位）注射法：将秋水仙素溶液注射到作用部位 l4 ）包埋法）包埋法 l5 ）毛细管法）毛细管法 l6 ）离体诱导（培养基法））离体诱导（培养基法） 秋水仙碱诱导蔬菜四倍体的方法秋水仙碱诱导蔬菜四倍体的方法影响诱导效果的因素：影响诱导效果的因素：l1 ）秋水仙素的浓度）秋水仙素的浓度 有效浓度：有效浓度：0.001%～～1.0%, 0.2%～～ 0.4%用的多 l2 ）处理时期与持续时间）处理时期与持续时间 l3）环境温度（）环境温度（25-28℃））六、多倍体的鉴定及后代选育六、多倍体的鉴定及后代选育 1 ．多倍体的鉴定．多倍体的鉴定 l1 ）直接鉴定）直接鉴定–染色体计数：检查花粉母细胞或根尖、染色体计数：检查花粉母细胞或根尖、芽等分生组织细胞的染色体数目芽等分生组织细胞的染色体数目–流式细胞术流式细胞术 ：利用流式细胞光度仪测定：利用流式细胞光度仪测定单个细胞的单个细胞的 DNA 含量，再根据含量，再根据 DNA 含含量比较推断出细胞的倍性。

量比较推断出细胞的倍性 l2 ）间接鉴定：）间接鉴定：–核体积测定核体积测定–根据植株形态特征、生长特性、细胞学根据植株形态特征、生长特性、细胞学特性、育性等进行判断特性、育性等进行判断l确定不同倍性国庆一号细胞直径的关系确定不同倍性国庆一号细胞直径的关系G1G62G（ µm ）4G（ µm ）28.7336.6229.0622.80D（ µm ）22.8028.73~29.0636.62~4G2G4G2GG1G6工作原理：让荧光染色的细胞在稳定的液流推动装置作用下通工作原理：让荧光染色的细胞在稳定的液流推动装置作用下通过直径为过直径为50-100um的小孔并排列成单行，每个细胞依次而且的小孔并排列成单行，每个细胞依次而且恒速通过激光束的照射区，细胞受激光照射后产生散射光和荧恒速通过激光束的照射区，细胞受激光照射后产生散射光和荧光通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞光通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或或RNA的含量根据所规定的参量可把指定的细胞亚群的含量根据所规定的参量可把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，以便进一步的研究分析从整个群体中分选出来，以便进一步的研究分析。

2 ．多倍体后代的选育．多倍体后代的选育 l无性繁殖植物：直接选择、固定无性繁殖植物：直接选择、固定 l一、二年生草花：进一步杂交选择，克一、二年生草花：进一步杂交选择，克服某些缺点，逐步消除不孕性服某些缺点，逐步消除不孕性 l注意嵌合体的分离注意嵌合体的分离 第二节第二节  单倍体育种单倍体育种 一、单倍体的概念与特点一、单倍体的概念与特点 1 ．单倍体的概念．单倍体的概念 l狭义：细胞体内只含有一个染色体组的植物如：狭义：细胞体内只含有一个染色体组的植物如：牡丹二倍体牡丹二倍体 2n=2x=10 ，单倍体，单倍体 n=x=5  l广义：具有该植物配子染色体数的植物广义：具有该植物配子染色体数的植物如：菊花如：菊花2n=6x=54 ，单倍体为，单倍体为n=3x=27“半倍体半倍体”    “多倍单倍体多倍单倍体” 2 ．单倍体的特点．单倍体的特点 l1 ）与二倍体形态基本相似：植株矮小，叶薄，）与二倍体形态基本相似：植株矮小，叶薄，花器较小花器较小 l2 ）生活力较弱）生活力较弱 l3 ）高度不孕）高度不孕 l4 ）加倍后成为纯合二倍体，恢复育性）加倍后成为纯合二倍体，恢复育性二、单倍体育种的概念和意义二、单倍体育种的概念和意义 1 ．概念．概念 l指利用诱发单性生殖（如花药培养）的方指利用诱发单性生殖（如花药培养）的方法，使杂交后代的异质配子形成单倍体植法，使杂交后代的异质配子形成单倍体植株，经染色体加倍成为纯系，然后进行选株，经染色体加倍成为纯系，然后进行选育获得新品种的方法。

育获得新品种的方法 2 ．． 意义意义 l1 ）克服杂种分离，缩短育种年限）克服杂种分离，缩短育种年限 l2 ）提高选择的正确性和效率）提高选择的正确性和效率 l3 ）节省田间试验的土地与劳力）节省田间试验的土地与劳力 l4 ）克服远缘杂种不育性与分离的困难）克服远缘杂种不育性与分离的困难 l5 ）快速培育异花授粉植物的自交系）快速培育异花授粉植物的自交系 l6 ）利用单倍体植物进行辐射和化学诱变）利用单倍体植物进行辐射和化学诱变 l7 ）直接利用其不育性）直接利用其不育性 三、获得单倍体的途径与方法三、获得单倍体的途径与方法 1 ．自然界产生单倍体的方式．自然界产生单倍体的方式 l1 ）） 孤雌生殖孤雌生殖 即由植物胚囊中的卵细胞与极核不经受精，单即由植物胚囊中的卵细胞与极核不经受精，单性发育成植株性发育成植株 l2 ）） 孤雄生殖孤雄生殖 l3 ）无配子生殖）无配子生殖 由胚囊中的反足细胞与助细胞不经受精发育而来由胚囊中的反足细胞与助细胞不经受精发育而来2 ．人工获得单倍体的途径．人工获得单倍体的途径 l1 ）诱导孤雌生殖：）诱导孤雌生殖：利用远缘的异属花粉授粉；利用远缘的异属花粉授粉；弱化花粉授粉弱化花粉授粉 / 延迟授粉；延迟授粉；用高剂量射线照射的花粉授粉；用高剂量射线照射的花粉授粉；化学药剂处理；化学药剂处理；异常变温处理；异常变温处理；机械刺激子房等。

机械刺激子房等 l2 ）离体诱导）离体诱导 花药培养（器官培养）；花药培养（器官培养）；花粉培养（细胞培养）；花粉培养（细胞培养）； 胚珠培养；胚珠培养；未授粉子房培养未授粉子房培养 四、花药培养的程序与技术四、花药培养的程序与技术 花粉培养的发育途径花粉培养的发育途径 ：： l花粉进行多次细胞内分裂，形成多细胞花花粉进行多次细胞内分裂，形成多细胞花粉粒粉粒 -----花粉粒破裂，形成类似胚胎发花粉粒破裂，形成类似胚胎发育的育的 “ 胚状体胚状体 ” -----分化出根和芽分化出根和芽 l花粉形成愈伤组织（脱分化过程）花粉形成愈伤组织（脱分化过程）-----愈伤诱导形成单倍体植株（再分化过程）愈伤诱导形成单倍体植株（再分化过程） 多数植物表现的途径多数植物表现的途径2 ．花药培养的程序．花药培养的程序 1 ）培养材料的选择）培养材料的选择 l选用优良的杂种一代或杂种二代中选出选用优良的杂种一代或杂种二代中选出的优良植株的花药进行培养的优良植株的花药进行培养 l选用易于诱导的材料选用易于诱导的材料 l选用优良杂交组合的后代选用优良杂交组合的后代 2 ）花药的离体培养）花药的离体培养 l外植体的选择外植体的选择 l外植体的预处理外植体的预处理 l培养基（大量元素、微量元素、有机成分、培养基（大量元素、微量元素、有机成分、 Fe 盐、蔗糖、固化剂、激素等）盐、蔗糖、固化剂、激素等） l外植体的消毒与接种外植体的消毒与接种 l培养条件（光照、温度）培养条件（光照、温度）l3 ）花粉植株的移栽）花粉植株的移栽 l4 ）单倍体的鉴定）单倍体的鉴定 直接鉴定：染色体计数直接鉴定：染色体计数 间接鉴定：形态特征、育性、分子标记等间接鉴定：形态特征、育性、分子标记等 l5 ）染色体加倍）染色体加倍 自然加倍自然加倍 人工加倍：秋水仙素、组培继代、扦插繁人工加倍：秋水仙素、组培继代、扦插繁殖等殖等 3 ．花药培养的基本操作技术．花药培养的基本操作技术 l1 ）玻璃器皿的准备与洗涤）玻璃器皿的准备与洗涤 l2 ）培养基的配制及灭菌）培养基的配制及灭菌 l3 ）花药的接种与培养）花药的接种与培养 l4 ）花粉愈伤组织的诱导与分化）花粉愈伤组织的诱导与分化 四分体四分体 -小孢子小孢子 -单核花粉单核花粉 -双核花粉双核花粉 （（最最适期适期）） 五、影响花药培养效果的因素五、影响花药培养效果的因素 l小孢子发育时期小孢子发育时期 l预处理预处理 l培养基培养基 l接种密度接种密度 l培养条件培养条件 l培养方法培养方法Sunderland（（1971））对烟草不同花粉发育对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察时期的培养反应进行了观察第七章第七章 诱变育种诱变育种l第一节第一节 诱变育种的意义和特点诱变育种的意义和特点l第二节第二节 诱变的方法诱变的方法l第三节第三节 诱变育种的方法与程序诱变育种的方法与程序l第四节第四节 提高诱变育种效率的方法提高诱变育种效率的方法第一节第一节 诱变育种的意义和特点诱变育种的意义和特点诱变育种诱变育种：人为的利用物理和化：人为的利用物理和化学因素诱导农作物发生变异，通过学因素诱导农作物发生变异，通过选择培育出新品种的方法。

选择培育出新品种的方法包括：包括：物理诱变物理诱变和和化学诱变化学诱变诱变育种的发展概况诱变育种的发展概况 l1895 年，伦琴发现年，伦琴发现 X 射线射线 l1936 年，年， WE Demol 用用 X 射线处理射线处理 Tulip ，经，经 10 余年育成突变新余年育成突变新品种品种‘法腊迪法腊迪' l1970 年，全球诱变品种年，全球诱变品种 101 个（观赏植物个（观赏植物 38 个）；个）； l1990 年，年， 1330 个（个（ 407 个）；个）； l2008年，年， 2254 个（个（ 765 个）个） ；包括菊花（；包括菊花（ 200 多个）、大丽花、六多个）、大丽花、六出花、秋海棠、月季、杜鹃、百合、香石竹等出花、秋海棠、月季、杜鹃、百合、香石竹等 l我国诱变育种起步于我国诱变育种起步于 1956 年，诱变育种的成绩位居世界首位至年，诱变育种的成绩位居世界首位至 2008年底，育成新品种年底，育成新品种 713 个，其中观赏植物近个，其中观赏植物近 300 个 l包括菊花、月季、小苍兰、瓜叶菊、朱顶红、美人蕉、紫罗兰、金包括菊花、月季、小苍兰、瓜叶菊、朱顶红、美人蕉、紫罗兰、金鱼草、矮牵牛、杜鹃、唐菖蒲、荷花、梅花等。

鱼草、矮牵牛、杜鹃、唐菖蒲、荷花、梅花等 （（1））physical induced mutation：：1904: De.Vries had a foresight to suggest the use of radiation to induce mutation.1908: Gager reported the result of induced mutation.1927：：Muller HJ. found a large number of mutant in fruit fly by X-rays.1934：Tollenear the first man who use radiation induced mutation bred a tobacco cultivar “Chlorina”.Later 20 century：laser breeding and space breeding .诱变育种的特点诱变育种的特点 1 ．突变率高，变异谱广．突变率高，变异谱广 自发突变：突变频率自发突变：突变频率10-4 ～～10-5；变异范围狭窄变异范围狭窄 诱发突变：突变频率诱发突变：突变频率可达可达3% ；变异范围广，类型；变异范围广，类型多，甚至可以产生自然界尚未发现的新基因源。

多，甚至可以产生自然界尚未发现的新基因源 l如四川省原子能研究所，采用如四川省原子能研究所，采用γ射线处理菊花插射线处理菊花插条条-花期从花期从 11 月提前到月提前到 4-10 月 l前苏联育种工作者，采用理化因素结合处理葡萄前苏联育种工作者，采用理化因素结合处理葡萄（（ 137 Cs γ 射线照射种子＋射线照射种子＋ 0.2% 秋水仙素处理秋水仙素处理子叶期幼苗生长点子叶期幼苗生长点) - 抗病性、枝型、叶形、果抗病性、枝型、叶形、果色、果形等大量的变异诱变频率为色、果形等大量的变异诱变频率为 1-3 ％ 2 ．可有效改良品种的单一性状，保持其它．可有效改良品种的单一性状，保持其它优良特性，诱发突变多为点突变优良特性，诱发突变多为点突变 3 ．育种程序简单，变异稳定快，育种年限．育种程序简单，变异稳定快，育种年限短短 –诱变多为一个主基因的改变，后代稳定快诱变多为一个主基因的改变，后代稳定快如一、二年生草花，如一、二年生草花， F3 可稳定，可稳定， 3-4 年即可年即可出品种 –园林植物多数采用无性繁殖，变异易固定园林植物多数采用无性繁殖，变异易固定Radiation induced apple red skin mutantcontrastmutantcontrastmutantcontrastmutantRadiation induced resistance of mutant4 ．打破原有的基因连锁，有利于基因重组．打破原有的基因连锁，有利于基因重组 5 ．克服远缘杂交不亲和性，改变植物育性．克服远缘杂交不亲和性，改变植物育性 6 ．诱发突变的方向和性质难以掌握，有利．诱发突变的方向和性质难以掌握，有利突变频率较低，突变位点随机；突变方向突变频率较低，突变位点随机；突变方向偶然（有益或无益）偶然（有益或无益） 7 ．改良的性状有限．改良的性状有限 –诱变往往是点突变，对某些受多基因控制的诱变往往是点突变，对某些受多基因控制的数量性状改良作用不大。

数量性状改良作用不大 8 ．变异性状具不稳定性．变异性状具不稳定性 –诱发的突变有时会发生逆突变，使已产生的诱发的突变有时会发生逆突变，使已产生的突变又恢复成原来的性状突变又恢复成原来的性状 –容易产生嵌合体，不利于性状的稳定容易产生嵌合体，不利于性状的稳定The strawberry irradiated  by Co60 in different doseckckck900R1200RThe seedling irradiated  by fast neutron in different dose菊花物理诱变结果菊花物理诱变结果Sectoral ChimeraSectoral ChimeraMericlinal Chimera第二节第二节 诱变的方法诱变的方法一一.物理诱变物理诱变用不同种类的射线处理，引起基因突用不同种类的射线处理，引起基因突变或染色体变异变或染色体变异紫外线紫外线l200-390nm; 250-290nml低能低能（（3.1-124eV））电磁辐射，非电离辐射电磁辐射，非电离辐射l微生物研究，花粉、孢子微生物研究，花粉、孢子l低压低压石英石英汞灯汞灯(15W)X射线射线l0.005-1nml核外电磁辐射核外电磁辐射lX光机：硬光机：硬X射线，软射线，软X射线射线γ射线射线l<0.001nml核内高能电磁辐射：核内高能电磁辐射：60Co, 137Cslγ照射室、照射圃、照射室、照射圃、Υ温室、人工气候辐照装置温室、人工气候辐照装置l应用最广的射线应用最广的射线浙江农科院的浙江农科院的Co60γ射线种植房射线种植房黑龙江农科院的黑龙江农科院的Co60γ射线温室（慢照射）射线温室（慢照射）四川农科院的钴圃全貌（慢照射）四川农科院的钴圃全貌（慢照射）粒子辐射粒子辐射l中子中子l带电粒子带电粒子其他物理诱变剂其他物理诱变剂l电子束：电子直线加速器电子束：电子直线加速器l激光：激光：200-1000nml离子注入离子注入航天搭载航天搭载l在卫星上搭载作物种子，利用空间环境技术提供在卫星上搭载作物种子，利用空间环境技术提供的微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁的微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁场等物理诱变因子进行诱变和选择，育成新品场等物理诱变因子进行诱变和选择，育成新品种。

种  “卫星卫星87-2”甜椒：单果平均重量由原来的甜椒：单果平均重量由原来的90g增加到增加到170g左右，最大果重左右，最大果重400～～500g维生素素C含量增加含量增加20%“宇航二号宇航二号”水稻：穗长由水稻：穗长由18cm增加至增加至22cm，每穗总，每穗总粒数由粒数由80粒增加到粒增加到158粒 每亩增产稻谷每亩增产稻谷155kg；粗蛋；粗蛋白含量由原品种的白含量由原品种的8.7%提高到提高到12.08%  太空黄瓜：成苗率增加一倍，突变单果重达太空黄瓜：成苗率增加一倍，突变单果重达1000g，最重，最重的达的达1800g辐射诱变的机理辐射诱变的机理 1 ．辐射对机体的作用．辐射对机体的作用 1 ）直接作用）直接作用 l射线直接击中生物大分子，使其产生电离或激发，射线直接击中生物大分子，使其产生电离或激发，引起原发反应引起原发反应 l靶学说靶学说 2 ）间接作用）间接作用 l射线作用于有机体的水，引起水的电离和激发，射线作用于有机体的水，引起水的电离和激发，产生自由基，这些自由基再作用于生物大分子，产生自由基，这些自由基再作用于生物大分子，导致突变的发生导致突变的发生。

 3 ）辐射生物学作用的时相阶段）辐射生物学作用的时相阶段 l物理阶段：辐射能量使生物体内各种分子发生电物理阶段：辐射能量使生物体内各种分子发生电离和激发；离和激发； l物理化学阶段：发生电离和激发的分子通过一系物理化学阶段：发生电离和激发的分子通过一系列反应产生许多化学性质高度活泼的自由基；列反应产生许多化学性质高度活泼的自由基； l生物化学阶段：自由基相互作用，并与周围其它生物化学阶段：自由基相互作用，并与周围其它物质发生反应，引起分子结构的变化；物质发生反应，引起分子结构的变化； l生物学阶段：细胞内生化过程发生改变，导致细生物学阶段：细胞内生化过程发生改变，导致细胞内各部分结构及组成发生变化，包括染色体畸胞内各部分结构及组成发生变化，包括染色体畸变和基因突变变和基因突变2 ．辐射对遗传物质的作用．辐射对遗传物质的作用 1 ）辐射对染色体的作用）辐射对染色体的作用 l引起染色体的断裂和重排：导致染色体的缺失、引起染色体的断裂和重排：导致染色体的缺失、重复、倒位、易位等重复、倒位、易位等 l引起染色体数目的改变（非整倍体）引起染色体数目的改变（非整倍体） 2 ）辐射对）辐射对 DNA 的作用的作用 l引起引起 DNA 链的断裂和修复链的断裂和修复 辐射诱变的优点辐射诱变的优点 l1 ．变异频率高，变异范围广，变异类型多．变异频率高，变异范围广，变异类型多 l2 ．可打破性状连锁遗传，实现基因重组．可打破性状连锁遗传，实现基因重组 辐射可引起染色体的断裂，实现双亲优良性辐射可引起染色体的断裂，实现双亲优良性状的重组状的重组 l3 ．克服远缘杂交的不亲和性．克服远缘杂交的不亲和性 处理方法处理方法:l1 ．外照射．外照射指指 辐射源辐射源 不进入植物体内，只是利用其射不进入植物体内，只是利用其射线（如线（如χ射线，射线，γ射线，中子）从外部照射植物各射线，中子）从外部照射植物各个器官。

个器官 特点：简单安全；适于处理大量试材；可进特点：简单安全；适于处理大量试材；可进行一代照射和多代重复照射，一次照射和多次行一代照射和多代重复照射，一次照射和多次照射l2 ．．内照射内照射 将放射性元素引入植物体内，由其放射出的射将放射性元素引入植物体内，由其放射出的射线在体内进行照射线在体内进行照射 处理方法：处理方法： 1 ）浸种法：将放射性同位素）浸种法：将放射性同位素32 P、、35 S 等，配成等，配成一定比例浓度的溶液，浸泡种子或枝芽一定比例浓度的溶液，浸泡种子或枝芽 2 ）注射或涂抹法：用注射器将放射性溶液注入植）注射或涂抹法：用注射器将放射性溶液注入植株或枝条内；或用放射性溶液涂抹叶片、枝条伤株或枝条内；或用放射性溶液涂抹叶片、枝条伤口等处 3 ）喂饲法（施肥法）：将放射性同位素施于土壤）喂饲法（施肥法）：将放射性同位素施于土壤或加入培养基中，经根部吸收进入体内或加入培养基中，经根部吸收进入体内表表 8-1 常见园林植物辐射诱变适宜剂量表常见园林植物辐射诱变适宜剂量表 植物种类植物种类 辐射材料辐射材料 射线种射线种类类 剂量剂量植物种类植物种类 辐射材料辐射材料 射线种射线种类类 剂量剂量菊花菊花 嫩茎嫩茎 X 0.8 ～～ 0.9 秋海棠秋海棠 叶叶 X 2 ～～ 3 菊花菊花 发根插条发根插条 γ 1 ～～ 3 毛叶秋海棠毛叶秋海棠 插叶不定芽插叶不定芽 γ 10 菊花菊花 发根插条发根插条 快中子快中子 0.3 ～～ 0.5 落地生根落地生根 叶叶 X 2 菊花菊花 组培芽点组培芽点 γ 1 ～～ 3 落地生根落地生根 幼苗幼苗 X ，，γ 1.5 ～～ 2 非洲菊非洲菊 幼株幼株 X 1 ～～ 6 阿美尼亚麝香阿美尼亚麝香兰兰 叶片叶片 X 1 ～～ 1.5 大丽菊大丽菊 新收获块根新收获块根 X 2 ～～ 3 阿美尼亚麝香阿美尼亚麝香兰兰 鳞茎鳞茎 X 3 ～～ 5 波斯菊波斯菊 发根插条发根插条 γ 1 ～～ 2 花叶兰花叶兰 种子种子 X 0.3 ～～ 0.4 绣线菊绣线菊 干种子干种子 γ 2 美人蕉（美人蕉（ 2x ）） 根茎根茎 γ 2 第三节第三节 化学诱变化学诱变一、化学诱变剂的种类及其作用机理一、化学诱变剂的种类及其作用机理 1 ．烷化剂类．烷化剂类–1 ）烷基磺酸盐类）烷基磺酸盐类(EMS甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯)和烷基硫酸盐类和烷基硫酸盐类–2 ）芥子气类）芥子气类 –3 ）乙烯亚胺和环氧乙烷类）乙烯亚胺和环氧乙烷类 –4 ）亚硝基烷基化合物）亚硝基烷基化合物 烷化剂的诱变机理：这些烷化剂带有一个或多个活性烷烷化剂的诱变机理：这些烷化剂带有一个或多个活性烷基，它们能置换基，它们能置换 DNA 分子的分子的 H 原子（烷化作用），改原子（烷化作用），改变基因的分子结构，导致突变。

变基因的分子结构，导致突变 2 ．核酸碱基类似物．核酸碱基类似物 –5- 溴尿嘧啶溴尿嘧啶 (5-BU) ：取代：取代 DNA 中的嘧啶，可以同中的嘧啶，可以同 A 和和 G 配对配对 –2- 氨基嘌呤氨基嘌呤 (AP) ：取代：取代 DNA 中的嘌呤，可以同中的嘌呤，可以同 C 和和 T 配对配对 3 ．吖啶类（嵌入剂）．吖啶类（嵌入剂） –吖啶黄，吖啶橙，原黄素吖啶黄，吖啶橙，原黄素–嵌入嵌入 DNA 分子双链中心的碱基之间，引起单一核分子双链中心的碱基之间，引起单一核苷的缺失或插入苷的缺失或插入 - 遗传密码编组的移动（移码突变遗传密码编组的移动（移码突变- 转录和翻译的错误转录和翻译的错误 , 产生突变产生突变4 ．无机类化合物：．无机类化合物： HNO2 、、 H2O2 、、 CuSO4 等等 5 ．简单有机类化合物．简单有机类化合物 –抗生素（丝裂霉素抗生素（丝裂霉素C、链霉素）、重氮丝氨酸等、链霉素）、重氮丝氨酸等 –引起染色体的断裂引起染色体的断裂 6 ．其它诱变剂．其它诱变剂 –羟胺（羟胺（ HA ）：作用于）：作用于 C ，使其氨基变成羟基，与，使其氨基变成羟基，与 A 配对。

配对–秋水仙素：诱导染色体数目的变异秋水仙素：诱导染色体数目的变异 二、化学诱变的优点二、化学诱变的优点 l1 ．操作简便，成本较低．操作简便，成本较低 l2 ．诱变效果具有一定的专一性．诱变效果具有一定的专一性 l3 ．破坏性较小，多引起基因的点突变．破坏性较小，多引起基因的点突变三、化学诱变的处理方法三、化学诱变的处理方法 1．前处理．前处理 –处理前用清水浸泡植物材料，如种子、鳞茎处理前用清水浸泡植物材料，如种子、鳞茎等，提高敏感性等，提高敏感性2．药剂处理．药剂处理 –浸渍法浸渍法 ；涂抹法；滴液法；涂抹法；滴液法 ；；–注入法；熏蒸法注入法；熏蒸法 ；施入法；施入法 3．后处理．后处理 四、四、 影响化学诱变效应的因素影响化学诱变效应的因素 1.诱变剂的浓度和处理时间诱变剂的浓度和处理时间 2.温度温度 （温度较高可提高诱变剂在植物体内的（温度较高可提高诱变剂在植物体内的反应效力反应效力 3.溶液溶液 pH 值值 4.不同植物材料的敏感性不同不同植物材料的敏感性不同第四节第四节 诱变材料的选择及突变体的鉴定、筛选诱变材料的选择及突变体的鉴定、筛选 一、诱变材料的选择一、诱变材料的选择 l1 ．选用综合性状优良的品种．选用综合性状优良的品种 l2 ．选择杂合度高的材料．选择杂合度高的材料 l3 ．选择易产生不定芽的材料。

．选择易产生不定芽的材料 如离体叶片：非洲紫罗兰、豆瓣绿、天竺葵如离体叶片：非洲紫罗兰、豆瓣绿、天竺葵等；鳞茎片：百合、朱顶红、郁金香、风信子等；等；鳞茎片：百合、朱顶红、郁金香、风信子等；茎芽：菊花、一品红等茎芽：菊花、一品红等 l4 ．尽可能选用单细胞或单倍体的植物材料．尽可能选用单细胞或单倍体的植物材料二、诱变后代的鉴定二、诱变后代的鉴定 l1 ．植物损伤鉴定．植物损伤鉴定 致死效应、半致死效应致死效应、半致死效应l2 ．细胞学效应鉴定．细胞学效应鉴定 染色体观察染色体观察 l3 ．突变体性状鉴定．突变体性状鉴定 统计分析统计分析三、诱变后代的培育和选择三、诱变后代的培育和选择 1 ．种子诱变后代的选择．种子诱变后代的选择 lM1 （指处理的种子长成的植株或蕾期前处理的植（指处理的种子长成的植株或蕾期前处理的植株）：常表现复杂的突变嵌合体，一般不作选择；株）：常表现复杂的突变嵌合体，一般不作选择；采取密植，多收种子采取密植，多收种子 lM2 （指（指 M1 所结的种子及由它长成的植株）：主所结的种子及由它长成的植株）：主要的分离、选择世代要的分离、选择世代 lM3 及以后各代：从及以后各代：从 M2 选出优良突变体，每株种选出优良突变体，每株种一小区。

若一小区若 M3 稳定，进入品种试验；如稳定，进入品种试验；如 M3 分分离，继续选择一般从离，继续选择一般从 M4 可进入品系鉴定可进入品系鉴定 2 ．无性繁殖器官诱变后代的选择．无性繁殖器官诱变后代的选择 l无性繁殖的园林植物在遗传上大多是异质的，辐射后发无性繁殖的园林植物在遗传上大多是异质的，辐射后发生的变异，通常在当代就可表现出来，后代选择可从生的变异，通常在当代就可表现出来，后代选择可从 M 1 开始 l但容易形成嵌合体，使突变性状难以显现或发生丢失，但容易形成嵌合体，使突变性状难以显现或发生丢失，应采取一定的措施促进突变细胞的分裂和分离应采取一定的措施促进突变细胞的分裂和分离 分离突变的方法：分离突变的方法： l不定芽技术：诱导处理材料产生不定芽不定芽技术：诱导处理材料产生不定芽 l修剪、嫁接及连续扦插修剪、嫁接及连续扦插 l应用离体培养技术应用离体培养技术 3 ．花粉诱变后代的选择．花粉诱变后代的选择 l用突变的花粉授粉的后代，整个植株可带上变异，用突变的花粉授粉的后代，整个植株可带上变异，成为异质结合体，不会出现嵌合体成为异质结合体，不会出现嵌合体 lM 1 --- 照射的花粉或照射处于配子体发育时期的照射的花粉或照射处于配子体发育时期的植株植株 lM 2 ---所结的种子（包括变异花粉所结的种子），所结的种子（包括变异花粉所结的种子），及由其长成的植株及由其长成的植株 ( 可进行选择可进行选择 ) lM 3 --- 出现性状分离出现性状分离 ØEfficient transgenic plant regeneration from embryogenic calli of citrus was established.ØMore than 400 transgenic calli was recovered and about 90 transgenic plant lines were developed.ØIntegration of the transgene into citrus genome was confirmed by histochemical GUS staining, Southern blot and Real-time RT-PCR.ØDisease resistance test revealed that that resistance was improved on some transgenic lines.Production of Transgenic ‘Anliucheng’ Orange Plants with the Xa21 Gene for potential Canker ResistanceLi DL, Duan YX, Tan B, Wu RC, Guo WW* (Correspondence: guoww@)National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, National Center of Crop Molecular Breeding, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China Introduction: Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (syn. Xanthomonas campestris pv. citri), is a serious disease of most commercial citrus cultivars. The Xa21 gene that provides broad spectrum Xanthomonas resistance in rice may have canker resistance potential in citrus since both pathogens are in the same genus. Herein, embryogenic calli of ‘Anliucheng’ orange (Citrus sinensis ‘Anliucheng’) were transformed with the plasmid pCXK1301 containing the whole Xa21 gene in the 9.6 kb KpnI fragment and two selectable markers hygromycin phosphotransferase (HYG) and β-glucuronidase (GUS) in the T-DNA region. With hygromycin selective regeneration system, over 500 transgenic calluses were recovered and more than 90 independently transgenic plant lines were achieved. GUS staining indicated only a few chimeras occurred in regenerated transgenic plants, which suggested regeneration of most somatic embryoids could be originated from single cells. PCR analysis showed that the ratio of positive transgenic plants were 85.6%. Southern blot revealed that Xa21 gene integrated into citrus genome with 1-2 copies and no gene was lost or rearranged during transgene regeneration. Real-time RT-PCR analysis revealed that Xa21 expression levels were low. By pathogen inoculation in vitro, transgenic plants displayed varied canker resistance levels with 14.8% transgenic resistance increase. It was concluded that calluses are good explant for citrus transformation and Xa21 gene has potential in canker resistance breeding.Fig. 1. The T-DNA  diagram of plasmid pCXK1301. LB: T-DNA right border; RB: T-DNA right border; HYG: hygromycin phosphotransferase; Xa21: rice Xa21 gene; GUS: β-glucuronidase. Fig. 2. Callus transformation and regeneration. The concentration 50 mg/L was selected for the whole process of regeneration; 1/2/3/4/: Stages of regeneration; +/-: Yes/No HYG in the medium. Fig.  3.  Regeneration  of  transgenic  embryogenic  calli  of ‘Anliucheng’ orange. A: the resistant calli growing on the medium after 3 times selection. B: Embryogenesis of transformed calli on the MT medium containing 2.0% glycerol without antibiotics. C: Shoot induced from the embryoid in the MT medium contain 0.5 mg/L BA, 0.5 mg/L KT and 0.1 mg/L NAA without HYG. D: Root induced from the shoot and obtained the plantlets. E: Transgenic plantlet in greenhouse. F: Transgenic plant population. Fig.  4.  Ploidy  analysis  by  flow  cytometry. No ploidy varition during transgenic plants regeneration. Fig. 5. GUS activity detection by histochemical analysis in different tissues of transformed citrus. A, B: The transformed calli stained strongly. C, D: the embryoid stained partially. E, F: Shoot and plantlets stained positively.Fig.  6. PCR  analysis  of  transgenic  ‘Anliucheng’  orange plants. HYG: 600 bp HYG gene fragment in transgenic plants. GUS: 400 bp GUS gene fragment in transgenic plants. Xa21: 1.4 kb Xa21 gene fragment in transgenic plants. Lane M is 1.0 kb (HYG and Xa21) and 100 bp DNA ladder; lane CK is non-transformed control, lane P is plasmid, lane 1-12 are transformed plants. PCR analysis confirmed the integration of HYG, GUS and Xa21 gene into citrus genome, and no gene lost during transgenes regeneration and growing.Fig.  7. Southern  blot  analysis  of  the  Xa21(A)  gene  and  HYG  gene from PCR-positive plants and non-transformed plant. Genomic DNA digested with HindIII. M: λ DNA/HindIII molecular weight marker, molecular weights are indicated in kilobases on the right. Lanes 1-10 transgenic plants and lane CK non-transgenic plant. Southern blot further confirmed the integration of HYG and XA21 gene into citrus, and none gene lost and rearranged during transgenes regeneration and growing.Fig.  8.  Relative  expression  levels  of  Xa21  gene  in  transgenic ‘Anliucheng’  orange  lines. Real-time RT-PCR analysis indicated that Xa21 expression levels was different in transgenic lines.ABCCrater-like lesionsFig.  9.Typical  leaf  lesions  of citrus  canker  on  bottom  of transgenic  plants  with  pinpricks inoculation. A: Whole leaf symptoms of citrus canker on bottom of transgenes. B, C: Close-up views of citrus canker lesions on bottom of transgenic plant leaf. +: Inoculated with pathogen; -: Inoculated with H2O. The white arrow indicates the symptom inoculated with water; the red arrow indicates the lesions inoculated withpathogen. Disease resistant test indicatedthat resistance was improved on some transgenic lines.Conclusion。