蛋白质含量测定法(一).docx

蛋白质含量测定法（一）蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有四种古老 的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin—酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法 另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（ Bradford 法）其中 Br adford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10〜20倍，比Biuret法灵敏100倍以上 定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白 质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果每种测定法都不是完美无缺的，都有其 优缺点在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③ 溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，适费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白质(Kjedahl 法)用于0.2~8〜10为氨，用酸吸收（可用三氯含量的准确测定；1.0mg氮，误小时后滴定乙酸沉淀蛋干扰少；费时太长差为±2%白质而分离）双缩脲法灵敏度低中速多肽键+碱性硫酸铵；用于快速测定，但(Biuret 法)1 〜20mg20~30CU2+?紫色络合Tris缓冲不太灵敏；不同蛋分钟物液；白质显色相似某些氨基酸紫外吸收法较为灵敏快速蛋白质中的酪各种嘌吟和用于层析柱流出50〜100pg5〜10氨酸和色氨酸嘧啶；液的检测；核酸的分钟残基在280nm各种核苷酸吸收可以校正处的光吸收Folin —酚试剂灵敏度咼慢速双缩脲反应；磷硫酸铵；耗费时间长；操作法（Lowry 法）心5递40 〜60分钟钼酸一磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法灵敏度最高快速考马斯亮蓝染强碱性缓冲最好的方法；(Bradford 法)1 〜5pg5〜15料与蛋白质结液；干扰物质少；分钟合时，其九maxTrito nXT0颜色稳定；由465nm变为0;颜色深浅随不同595nmSDS蛋白质变化一、 微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨经 强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮 含量若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH CH COOH+3H SO —— 2CO +3SO +4H O+NH （1）2 2 2 4 2 2 2 32NH +H SO ——（NH ） SO （2）3 2 4 4 2 4（NH ） SO +2NaOH——2H O+Na SO +2NH （3）4 2 4 2 2 4 3 反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行为了加速消化，可以加入CuSO作催化剂，KSO以提高溶液的沸点收集氨可用硼酸溶液，滴定4 2 4则用强酸实验和计算方法这里从略计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6．25 即得二、 双缩脲法（ Biuret 法）一）实验原理 双缩脲（NHCONHCONH ）是两个分子脲经180°C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物在强33碱性溶液中，双缩脲与 CuSO 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接4 连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用 来测定蛋白质含量测定范围为l-10mg蛋白质干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓 冲液和某些氨基酸等此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少主要的缺点 是灵敏度差因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定二）试剂与器材1. 试剂：（1） 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A为0.66来校正其纯度如有需要，标准蛋白质还280可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白 质溶液牛血清清蛋白用HO或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0. 05N NaOH配制2（2） 双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO・5H 0）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC HO・4H4 2 4 46 20）,用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料 瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。

此试剂可长期保存若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新 配制2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0毫升的 标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂充分摇匀后，在室温（20〜 25C ）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对 照液取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线2、 样品的测定：取2〜3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度注意样 品浓度不要超过 10mg/ml蛋白质含量测定法（二）三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙 的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代此法的显色原理与双 缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检 测蛋白质的灵敏度这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜 结合生成复合物。

Folin—酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基 还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤以后在生物化学领域得 到广泛的应用这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精 确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多对双缩脲反 应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应而且对后者的影响还要大得多酚类、柠檬酸、 硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用浓度较低的尿素（0.5%），硫酸 纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液 对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢 氧化钠溶液，即可显色测定若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶 液的浓度1〜2倍进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上 述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin —酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时，必 须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定此法可检测的最低蛋白质量达5递通常测定范围是20~250递二）试剂与器材1. 试剂（ 1 ）试剂甲：（A） 10克Na CO，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaCHO・4H 0）溶解于500毫升2 3 4 4 6 2蒸馏水中B） 0.5克硫酸铜（CuSO・5HO）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）42与1份（B）混合，即为试剂甲⑵试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠H叫・2H2°），25克钼酸钠H MoO4・2H2及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流 管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（导°4），50毫升蒸馏水及数滴 液体溴，开口继续沸腾1 5分钟，以便驱除过量的溴冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重 复滴加液体溴的步骤）稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右3）标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或丫一球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250卩 g/ml左右。

牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液2. 器材（ 1）可见光分光光度计（ 2）旋涡混合器（ 3）秒表（ 4）试管 16 支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管， 1支作空白， 3支留作未知样品，其余试管分成两组， 分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250卩g/ml）用水 补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20〜2 5°C）放置10分钟再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀这一步混 合速度要快，否则会使显色程度减弱然后在室温下放置 30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支 试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值以蛋白质的量为横座标，吸光度值 为纵座标，绘制出标准曲线注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支 试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3支试管，余此类推全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5 毫升试剂乙， 1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙， 2分钟后加第3支试管，余此类推。

待 最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收每分钟测一个样品进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格 表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入最下面两排 是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值Folin—酚试剂法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(250pg/ml)未知蛋白质 0.2 0.4 0.6(约 250yg/ml)蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4试剂甲5.05.05.05.05.05.05。