实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质ppt课件.ppt

实验二、葡聚糖凝胶柱层析1、目的与要求：、目的与要求：　1.1、学习凝胶(Gel)层析法的根本原理；　1.2、 掌 握 葡 聚 糖 凝 胶 〔 Sephadex〕 柱 层 　 　 　析的操作技术2、概述及原理：、概述及原理：　凝胶　　是一类不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有立体网状构造的物质〔如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等〕 2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：　目前主要有葡聚糖凝胶〔商品名为Sephadex〕，天然琼脂糖凝胶〔商品名为Sapharose〕、聚丙烯酰胺凝胶〔商品名为Bio-Gel〕，其后还开展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖〔CM-Sephadex〕，二乙基氨乙基-交联葡聚糖〔DEAE- Sephadex〕等种类 交联葡聚糖凝胶 ：　是凝胶层析法中运用最广泛的一类层析凝胶，商品称号：Sephadex其根本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基经过α－1，6糖苷键衔接而成，葡聚糖分子之间经过醚桥〔甘油基〕交联构成三维空间网状构造 2.2、不同型号的葡聚糖凝胶　(Sephadex) 的选用原那么： 　　 组别分别时，Sephadex G－25最为常用。

例如样品中缓冲液的改换，蛋白质的脱盐 ； 分级分别时〔如多蛋白质组分样品的分别纯化〕，应根据待分别样品中各组分的分子量大小和分子量分布范围来确定型号 　2.3、凝胶层析法的原理：　凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应当洗脱开场以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快分子量大小不同的多种成份在经过凝胶床时，按照分子量大小“排队〞，凝胶表现分子筛效应 层析柱的重要参数 ： 　　Vt(total volume)　 Vo(outer volume)　　Vi(inner volume)　 Ve(elution volume) 　　Vg(gel volume) 　　Vt=Vo+Vi+Vg , 　　Ve=Vo+Kd×Vi组分的洗脱体积〔Ve〕：①当样品的体积很少时〔与洗脱体积比较可以忽略不计〕 ，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve ②当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置③当样品体积很大时，洗脱体积计算可以从运用样品开场到洗脱峰升高的弯曲点〔或半高处〕 Kd是是分分配配系系数数：：用用于于衡衡量量两两个个物物质的的分分别分分辩率率，，是是凝凝胶胶层析析的的一一个个特特征征常常数数，，只只与与被被分分别物物质分分子子大大小小和和凝凝胶胶孔孔径径大大小小有有关关，，与与层析析柱柱的的长短粗短粗细无关。

无关Kd值的的计算：算：Kd=(Ve-Vo)/Vi几个特征几个特征Kd值意意义：：　　　　 ①①Kd=0,那么那么Ve=Vo ，全排阻；，全排阻；　　　　 ②②Kd=1,那么那么Ve=Vo+Vi , 全全掺入；入；　　　　 ③③0＜＜Kd<1,那么那么Ve=Vo+Kd×Vi ，部分，部分掺入；入；　　　　 ④④Kd>1，，那那么么Ve>Vo+Vi ，，如如某某些些芳芳香香族族化化　　 　　 　　 　　 　　 合合物物〔〔Phe,Tyr,Trp 等等〕〕，，Sephadex G-25对它它们有吸附作用有吸附作用 　　　　　　　　　　2.4、影响凝胶层析分别的要素：　　2.4.1、样品的体积、粘度； 　　2.4.2、层析柱 ；　　2.4.3、洗脱液流速的影响 ；　　2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响 2.4.1、样品的体积、粘度： 分析分别时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分别时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 　样品液粘度与洗脱液粘度的比值分别效果只与相对粘度有关，普通来说，相对粘度不得超越1.5―2 今天的上样量〔0.4ml〕约为1%柱床体积。

2.4.2、层析柱： 　①柱长：组别分别时，20－30厘米；　　　　　分级分别时，可长至100厘米；　②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱盐)，20:1─100:1 (纯化) 　今天选用的是1cm ×30cm的层析柱2.4.3、洗脱液流速的影响： 洗脱液的流速与样品分别的分辨率相关流速过快，会使色谱峰变形，　流速过慢，样品分散倾向加剧　普通流速控制在30－200ml/h 　 今天洗脱流速控制在1ml/min2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响： 纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐溶液作洗脱剂，以添加样品的溶解度和消除凝胶的吸附作用；酸性组分应选用偏碱性洗脱液；碱性组分应选用偏酸性洗脱液2.5、凝胶层析法的运用：　1、生物分子的分别提纯； 　2、测定高分子物质的分子量 ；　3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ；　5、用于去除热原物质 2.6、凝胶的防腐、保管： Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质，易于长菌，因此常在凝胶〔不用时〕中参与抑菌剂，运用时再除去常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂1厘 米 光 程 时 ， 254nm处 透 光 率 为 60％ ， 　　　　　　 280nm处透光率为100％。

3、试剂、器材：、试剂、器材：　3.1、层析介质　　 Sephadex G-50；　3.2、样品〔包含三个组分〕：　　　　　　　　　　　　　①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp 　　上样量：0.4ml/柱　3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水　3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分搜集器、核酸蛋白检测仪、记录仪 　　　　　　4、实验操作过程：、实验操作过程：　4.1、凝胶的溶胀　4.2、装柱；　4.3、上样； 　4.4、洗脱和搜集 　4.1、凝胶的溶胀： 　将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适量洗脱液，沸水浴溶胀2小时〔也可室温24小时〕　沸水浴溶胀的益处：省时，还可消毒，　　　　　　驱除凝胶颗粒内部的气泡 4.2、装柱： 　　①流程： 4.2、装柱： ②装柱：　干净的层析柱调整固定在垂直形状，柱内装放适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡，封锁出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液，参与搅拌均匀的凝胶浆液，翻开出口，控制流速，凝胶随柱内溶液渐渐流下而均匀沉隆到层析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层析柱上部，留意凝胶面上应一直坚持有洗脱液调理流速1ml/min。

床面上覆盖尼龙膜或滤纸〔对操作熟练者不需求而且不放更好〕4.3、上样： 上样前柱子要平衡翻开上接头，用吸管吸去床面上大部分洗脱液，当洗脱液面接近凝胶床面时，封锁层析柱出口端，用吸管汲取样品混合液0.4毫升，沿管壁小心加样于柱床外表，翻开层析柱出口端，待样品完全掺入胶内，开场搜集流出液，同时小心加满洗脱液，衔接好层析柱上接头，经过泵控制流速：1ml/min 样品中组分的分子量差别特别大，颜色也不一样，可使同窗们直观地察看到层析分别过程4.4、洗脱和搜集： 流速1ml/min不变，3ml/tube搜集流出液，核酸蛋白检测仪的灵敏度定在0.2，记录仪纸速6cm/h，电压50mV，部分搜集器：3min/tube　　最后，根据记录的实验结果，计算层析　 　 　 柱的Vo、Vi以及样品的Ve、Kd。