苹果树腐烂病菌知识讲义.docx

刖s苹果树腐烂病是出Valsa mail Miyabe & Yamada引起，是危害苹果枝干的世界性病害之一， 在各苹果产区均有发生，危害严重，尤其在东亚地区(Sakuma 1990; Uhm and Sohn 1995) 该病主要危害主干、主枝，导致皮层腐烂，造成死枝、死树，重者毁园，降低苹果的产量、 品质，严重危害着苹果产业的发展19世纪末，苹果树腐烂病首次在日木北海道发生20世 纪初，日木的宫部和山H并将其致病菌定名为Valsa mali Miyabe et Yamada, (Tanakal919)o 中国苹果树腐烂病菌由三个种类组成，即Valsa mali Miyabe et Yamada, V. malicola Z. Urb和 V. persoonii ( = Leucostompersoonii), 而 Valsa mali 是由 V. mali var. mali ( Vmm) 和｝/. mali var.pyri CVmp)组成，其中〃加在中国各苹果产区普遍存在，是导致中国苹果腐烂病的主要 致病菌(Zang2012,WangXL2011)苹果树腐烂病菌属于弱寄生真菌，具有潜伏侵染的特性，一般是从伤口侵入已经死亡的皮 层组织，但也可从叶痕、果痕和少数皮孔侵入皮层组织，被侵伤口包括修剪伤口、机械伤、 冻伤、H 灼伤(Willison 1936; Biggs 1989; Kepley andJacobi 2000; Adams et al. 2006； ChenC 1981)o修剪伤口即剪口，是腐烂病菌侵染的主要途径，由剪口侵染的腐烂病菌潜伏在木质部 导管内，当腐烂病菌生长扩展到达韧皮部突破寄主栓皮层才会导致剪口的发病，这也是【口病 疤复发和新病疤产生的主要原因，因此一般的化学防治方法很难有效的控制腐烂病的发牛和 流行(Tamura and Saito 1982；王彩霞2012)。

由剪I」侵染引起苹杲病害的另一重耍病菌是 苹果轮纹病菌，危害枝干和果实，造成干腐症状苹果轮纹病菌除从气孔、皮孔侵入外，更 容易从伤口侵染，尤其是剪锯口的侵染(董娟华2009； R.D.Milholland 1972) 0从剪口侵染 的轮纹病菌可沿着皮层扩展，形成溃疡斑，造成干腐症状，遇到雨季即可产生大量砲子，为 轮纹病的侵染提供了大量菌源(李保华2013； Sutton TB 1981)o苹果轮纹病最早发生在日本的梨和苹果上，1911年Grossenbacher和Dugga将其定名为 Botryosphaeria ribis Gross.et £>wg(Fenner E 1925)苹果轮纹病不仅可以侵染枝条也可侵染果实, 造成同心轮纹烂果症状随着主栽富士品种的人面积种植，轮纹病的危害不断加重，造成采 收前的大量烂果，严重影响了苹果产业发展(陈策1999)随着果实套袋技术的发展，果实 轮纹病得到了冇效控制，但枝干轮纹病日趋加重，而且随着树龄的增大，枝干轮纹病的危害 逐渐加重，对中国苹果主产区造成了严重的经济损失(国立耘2009) o近几年來，中国大血值推广矮化密植栽培技术，结果枝需要不断更新，形成了大量剪II,这为轮纹病菌的侵染提 供了重要途径，造成了苹果苗期带菌，严重危害新建果园的发展。

苹果腐烂病和轮纹病均可通过剪口侵染，造成树体发病，严重削弱树势目前，对这两种 病菌从剪口侵染的相关机理了解很少，生产上述没有有效的防控措施本研究以剪口的侵染 为突破口，采用人工接种的方法研究了露温、露时对腐烂病菌和轮纹病菌侵染剪口的影响以 及温度对腐烂病菌在木质部内的扩展的影响，为深入了解剪口处腐烂病菌和轮纹病菌的侵染 规律和枝干病害的防控提供依据和参考材料和方法1・1病原菌及他了繁殖苹果树腐烂病菌（巾他加”）于（时间）釆自（地点），通过切取病健交界处的病组织 转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，获得腐烂病菌用直径0.8mm的毛细管，门菌落 边缘打取菌丝的头部转入PDA中，获得单菌丝分离菌株，编号为LXS08090k用农杆菌介导 转化法（ATMT）将携带潮霉素B磷酸转移酶基因（/卯力）和绿色荧光蛋白表达基因（加）转入腐烂 病菌，获得转化子LXS080901-16o经离体和活体的接种试验，转化子LXS080901-16和 LXS080901在苹果枝干上都能导致典型的腐烂病症状，二者的致病性无差异，与皿间自然发 病症状没有差异接种前，将在4C冰箱中保存菌种取出，接种于PDA培养基中，25° C黑暗培养3天, 取菌落边缘直径5mm新鲜菌饼，接种于人麦粒培养基（带壳大麦粒清水浸泡2h,称取70g,加 入30ml 6%的蜂蜜水和1%的蛋口月东，高压蒸汽灭菌lh） , 25° C恒温箱中培养15天，大麦 粒产生大量分生砲子器。

取产生分生砲子器的大麦粒，转入含冇1%琼脂的直径为9cm培养 皿中，25° C下保湿培养3天，分生砲子器中溢出橘黄色分生砲子角（赵红）挑取新鲜分生砲 了角置于纯净水中，配成106个/ml抱了悬浮液备用室外接种用野生菌株（LXS080901）,室 内离体枝条接利川转化子（LXS080901J6）用转化子接种的材料在试验结束后全部销毁苹果轮纹病菌于2008年采自山东莱阳市水沐头村的果园，切取富士苹果枝条上的病瘤 用PDA进行组织分离，获得组织分离病菌将组织分离菌丝转接到富士苹果幼果上，黑光灯 下诱导产抱（冷伟锋2009）,通过毛细管挑取单砲（萤娟华2009 ）传入PDA中培养，获得单抱分离菌株，编号为LXS030101o单抱菌株回接富士苹果果实和枝条，都能表现典型的轮 纹病症状，与野生菌株的致病性无差异接种前将在冰箱内保存的轮纹病菌在PDA培养基上培养5-7天，然后打取菌饼转接到 富士苹果60日龄的幼果上接种幼果3〜5天后发病，然后置于黑光灯（波长365nm） F诱导 产砲挑取新产生的分生砲子，用纯净水配置成10°个/ml抱子悬浮液备用1.2露温和露时对腐烂病菌分牛他子口剪锯口侵染的影响试验测试了 7个露温和7个露时对腐烂病菌分生抱子自剪锯口侵染的影响。

7个露温分别 为 5°C> 1（TC、15°C> 20°C> 25°C> 30°C 和 35°Co 处理温度由恒温箱控制（BluePard MGC- 250BP-2, Shanghai Bluepard Instruments Co. Ltd.）,接种前12小时开启恒温箱，设定和应温度 7个露时处理分别为接种后保湿Oh、lh、3h、6h、12h、24h和48h全部试验共49个露温与 霜时组合，每个组合处理3个枝条3月份苹果萌芽前，自5年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用消毒的枝剪， 将枝条截成20cm枝段，保持剪口整齐3个一组，插入组培瓶内，加入蒸徭水，使枝条基部 浸入水中2cmo将水培枝条转入相应温度的恒温箱内预处理12小时接种时，从恒温箱中取 出枝条，用手持喷雾器，将腐烂病菌LXS08090I-16菌株的分生抱子悬浮液均匀喷布到枝条 的新鲜剪口上，直至剪口处有砲子悬浮液流下接种后，除露时处理为Oh的枝条不套塑料袋, 其他露时处理的枝条，每个枝条套一个塑料袋，然后放回到相应温度的恒温箱中至处理露 吋结朿，解除套在枝条上的議料袋，再放回到恒温箱中继续培养试验期间，恒温箱内的相 对湿度为50%-80%之间，解袋后,剪口表面的露水约在20分钟内消失。

接种72小时后，将 全部枝条取出，将接种端浸入75%的酒精，保持10秒钟，已杀死剪I」表面未能侵染的病菌, 然后转入温度256相对湿度为75%的人工气候箱中再培养7天处理结束将枝条取出，口接种端开始以1cm为单位，用消毒枝剪（每剪切一次，用75% 的酒精擦拭消毒20秒）从每个接种枝条上依次截取5个枝段，然后以髓部为小心按十字交叉 法，将每个茎段平均分成4块枝条组织，转接到PDA培养基中，每川L 4块，在25°C下培养 从笫2天开始，每天检查毎块分离组织内是否有菌丝 <出，直到第10天结束若分离组织内 冇菌丝长岀，挑取菌丝在荧光显微镜下（荧光波长为？ ？）观察，若菌丝内冇绿色荧光，则 推断该菌丝为接种腐烂病菌的菌丝，接种病菌已生长扩展至该部分组织内检查结束，计算每个处理同一深度12个枝段中带菌组织的块数和带菌百分率全部试验在不同时间重复3次 每次重复恒温箱随机分配1.3露温和露时对轮纹菌分生砲子自剪锯口侵染的影响试验测试了 6个露温和5个露时对苹果轮纹病菌分生抱子自剪锯口侵染的影响6个露温 处理分别为10°C> 15°C^ 20°C. 25°C> 30°C和35°C,分别rfl 6台恒温箱控制。

5个露吋处理 分别为接种后保湿0h、lh、4h、12h和24h全部试验共30个露温和露时组合，每个组合接 种3个枝条，以接种清水的枝条为对照8月份，自5年生旺盛生长的富士苹果树上，选取40・60cm长的当年生健康枝条，从已 木质化的部位剪除梢部，形成剪锯口让新鲜剪锯口在树体上生长3〜5天后，剪取长度为 15cm的枝段，用于接种接种枝条每3个一组水培，并置于相应温度的恒温箱中，预处理 12小时接种时，用手持喷雾器，将轮纹病菌LXS030101菌株的分生抱子悬浮液均匀喷布到 3-5 H龄的剪锯口，宜至剪口处有抱子悬浮液流下接种后，除露吋为0小时的处理外，其他 露时处理的枝条，每个枝条套一个塑料袋，然后放回恒温箱中至保湿处理时间结束，解去 塑料袋，让接种枝条在同一恒温箱中自然晾干接种枝条于接种后72小吋，全部取出，将接种端在75%的酒精中浸泡10秒，以杀死表 面未能侵染的病菌，然后转入温度30°C,相对湿度为75%的恒温箱中，再培养3周当枝条 皮层自接种端出现宽度长于5mm褐色坏死斑，记为发病全部试验在不同时间重复3次，每 次重复恒温箱随机分配1.4温度对腐烂病菌在木质部内扩展的影响试验设置5°C> 10°C> 15°C> 20°C> 25°Cs 30°C和35°C七个处理温度，每个温度接种6 个枝条。

温度由恒温箱控制，试验前12小时开机并设定相应温度3刀份苹果萌芽前，口 5年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用消毒的枝剪， 将枝条截成42个长度为20cm枝段，保持剪口整齐接种时，用手持喷雾器，将腐烂病菌 LXS080901-16菌株的分生抱子悬浮液均匀喷布到在枝条的新鲜剪口上，直至剪口处冇抱子悬 浮液流下接种后，每个枝段套一个塑料袋保湿，然后置于25恒温箱水培48小吋后，取 岀接种枝条，6个一组，传入7个不同恒温箱中再培养7天处理结束将枝条取出，口接种端开始以1cm为单位，用消毒枝剪从每个接种枝条上依次 截取5个枝段，然后以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成4块枝条组织，转接 到PDA培养基中分离检查病菌检查结束，计算毎个处理同一深度24个枝段中带菌组织的 块数和带菌百分率全部试验在不同时间重复3次每次重复恒温箱随机分配1.5剪口木质部接种病菌分生砲子后的发病动态2013年3刀24日，在青岛农业大学胶州科技示范园3年生的富士苹果树上，随机选取 直径大于0.8cm的枝条200枝，离基部5cm-10cm处剪除枝条，形成剪口，并标记自3月 31 F1开始，每隔一个月接种20个枝条。

接种时，用灭菌牙签挑取大麦粒上产生的生砲子角 （LXS080901菌株）置于剪口木质部中央,用湿润脱脂棉球包裹,外部包扎塑料膜,保湿48小 时接种后，每隔一个月检查记录接种枝条的发病情况，当剪口下方枝段出现长径超过lcm 的典型腐烂病斑时，记为发病2结果2」露温和露时对腐烂病菌口剪锯口侵染的影响腐烂病菌的分生孑包子在52、1（TC、15°C> 20°C> 25°C> 30°C和352下均能通过剪锯口 侵入苹果枝条的木质部，但不同温度下，分生泡子的侵染数量和侵入菌丝在木质部内扩展的 距离有所差异在距接种点3cm。