秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析.docx

秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析姓名摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA引起 的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法本次实验通过饲喂 的方法，观察外源RNA分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解RNA干扰的原理、特性及其应用通过 此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果关键词：秀丽隐杆线虫、RNA干扰（RNAi）、饲喂法1．引言秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫在理想的条件下（充足食物20°C）生命周期大约为4d秀丽隐杆线虫成体长1〜1.5mm,体宽约70ym，全身透明，以 细菌为食，全身共有959个细胞研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）从1965年 开始，Sydney Brenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之 一线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫 雌雄同体的性染色体为XX,而雄虫性染色体为X0雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又 产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。

在 雌雄同体自交繁殖中以0.2%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄 体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated, Unc）、短胖（dumpy， Dpy）、打卷（roller, Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上 这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利此外，线 虫还有许多组织特异性标记的品系秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20C仅需4d卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的 几丁质的外壳，在母体内就开始分裂从母体产出的卵大约处于30个细胞期胚胎发生很 有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫从孵化到成体，线虫经历4个幼虫阶段（L1〜 ⑷和4次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长蜕皮的时间20C）分别是孵化 后13、21.5、29.5和41h；身体长度分别是350、470、640和890ym秀丽隐杆线虫孵化后 约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默 （PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。

目前，虫中发展出3种不同的RNAi实验操作方法：①注射（injection） dsRNA； ②将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的dsRNA溶液中；③用表达dsRNA的工程菌（E.coli 饲养（feeding）线虫这3种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功 能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道此次实验培养出RNAi型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总RNA反转录 合成cDNA, cDNA经过RT-PCR产生Gene, Gene经过双酶切产生Gene片段另外L4440质 粒双酶切形成线性L4440质粒Gene片段与线性L4440质粒经过T4 DNA连接酶连接形成 L4440质粒-Gene, L4440质粒-Gene转入到E.coliHT115（DE3）中进行阳性克隆阳性克隆 后进行PCR鉴定之后将阳性克隆产物进行IPTG诱导形成Gene-dsRNA,将其通过饲喂法导 入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi型秀丽 隐杆线虫2．材料和方法2.1 材料、试剂和器材实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2）、大肠杆菌OP50、大肠杆菌HT115 （DE3）、6种 不同的RNA干扰菌株HT115 （含有能表达不同gene dsRNA的质粒，对应的性状编号分别为： bli-2、 dpy-2、 dpy-5、 him、 sma-2、 lon）实验试剂： LB 液体培养基、 NGM 固体培养基实验器材：实体显微镜、显微镜、粘虫器（pick）、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜2.2 方法2.2.1 活化大肠杆菌 OP50打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。

取一个灭菌后的15mL 离心管，用微量移液器向其加入3mL LB液体培养基，再向其中加入300"大肠杆菌OP50将15mL离心管放入37°C恒温摇床中振荡培养过夜（8〜12h）2.2.2大肠杆菌OP50涂平板大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始 无菌操作用微量移液器取200"菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口将接种后的平板置于37C恒温培养箱中培养6〜7小时2.2.3 向 NGM 培养基平板中接种线虫从老师提供的线虫培养板中选取有卵的或者L1、L2期雌雄同体线虫（生长时期保证一 致），用粘虫器（pick）挑取这些线虫接种到NGM培养基平板中，用封口膜将平板封口记 录接种的线虫所处的生长时期和接种时间，根据线虫生长时期与温度的关系与自己的实际时 间情况合理确定线虫培养方案，选择在不同温度的恒温培养箱（20°C和25°C ）中的培养时 间，将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）2.2.4 活化干扰菌株和涂干扰板 在步骤2.2.3进行的期间，要进行活化干扰菌株和涂干扰板打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。

取7个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其中 加入 3mL LB 液体培养基和 3^L Amp,再分别加入 300^Lbli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2 和 lon6种干扰菌株以及阴性对照HT115菌株，用微量移液器吹吸混匀将这7个15mL离心管做好标记，放入37C恒温摇床中振荡培养过夜（12〜16h）之后取7个NGM培养基平板， 在超净工作台中，用微量移液器分别取200〜300" 7种活化好的菌液加入到NGM培养基平 板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口，在平板的皿底和皿盖上同时做好标记将干扰板置于37C恒温培养箱中培养6〜16小时此步骤要求这7个干扰板接种的菌株培养好的时间与步骤2.2.3中将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）的时间一致2.2.5向7个干扰板中挑取L4期线虫步骤2.2.4中7个干扰板接种的菌株培养好后，步骤2.2.3中的线虫也培养至第四幼虫 期（L4期线虫）此时用粘虫器（pick）分别向7个干扰板中挑取10条L4期雌雄同体线虫, 用封口膜将平板封口挑取线虫后将干扰板置于20°C恒温培养箱中培养2d2.2.6挑取4〜5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中2d后挑取4〜5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中，用封口膜将平板封口。

与原干 扰板共同置于20C恒温培养箱中培养5d2.2.7观察两个干扰板中的后代表型，统计突变型出现的频率3 •结果此次实验中使用了 6种不同的RNA干扰菌株HT115 （含有能表达不同gene dsRNA的质 粒），对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、Ion同时还使用了起阴 性对照作用的RNA干扰菌株HT115，即转入了 RNA干扰质粒空载体L4440的HT1151）接种了 RNA干扰菌株HT115的平板起阴性对照的作用，线虫不发生突变如图一 所示图一阴性对照的平板中线虫不发生突变图一中的线虫都是雌雄同体线虫，个体比雄虫稍大，产卵器位于身体的中部，体内可见 卵或胚胎图二是在10X低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫图二10x低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫（2）接种了 bli-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫身上 表皮起泡（尤其是头部），线虫比野生型稍小如图三所示图三接种bli-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图三中可以很明显地观察到突变线虫头部表皮起泡3）接种了 dpy-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫粗 短，身体向左转弯，身体僵硬，幼虫正常。

如图四所示图四接种dpy-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图四中可以很明显地观察到突变线虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬4）接种了 dpy-5干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫非 常粗短，幼虫正常如图五所示图五接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫图五中“A”是突变线虫，“B”是未突变线虫（即野生型线虫）二者对比可以很明显 地看出突变性状图六是在10X低倍镜下观察接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫图六10X低倍镜下接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫图六中“A”是未突变线虫（即野生型线虫），“B”和“C”是突变线虫二者对比可以 很明显地看出突变性状5）接种了 him干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是在干扰板 中雄虫出现率提高如图七所示图七接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫图七中“A”和“B”是雄虫，“C”、“D”和“E”是雌雄同体线虫雄虫比雌雄同体线 虫身体细、颜色浅，尾部的交配器呈扇形（三角形）不过虽然接种了 him干扰菌株的干 扰板中雄虫出现率提高，但是雄虫出现的频率仍然较低图八是在10X低倍镜下观察接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫。

图八10x低倍镜下观察接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫图八中“A”是雄虫，“B”、“C”和“D”是雌雄同体线虫图中可以很明显地看出雄虫 比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器由于被雌雄同体线虫挡住无法观察到扇形 （三角形）还可以看到雄虫体内的消化管和储精管6）接种了 sma-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫比 野生型短小如图九所示图九接种sma-2干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫短小的性状并不明显，较难观察图九中A”（突 变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状7）接种了 Ion干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫各个 发育阶段均较野生型长，头部和尾部变尖如图十所示图十接种lon干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察图十中“A”（突 变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状图^一是在10X低倍镜下观察接种Ion干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫图十一 10X低倍镜下观察接种Ion干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。

图十一中A”（突 变线虫）和“B”、“C”（未突变线虫）的对比可以较清楚地观察出突变性状4 •讨论RNAi是一个奇特的生物现象，在许多物种中特殊的dsRNA的表达会导致相应的mRNA 降解使得该基因的功能几乎完全丧失应用这项技术可以方便的找出突变的表型而不必去费 力的分离一个突变的基因本从而大大加快了研究的进程RNA干扰机制是如下所示：第一步（起始阶段），dsRNA在内切核酸酶（Dicer酶）作用 下加工裂解形成21〜23nt的siRNA；第二步（效应阶段），是由siRNA中的反义链指导形成。