电泳技术在农作物种子纯度检验中的应用及需要解决的问题.pdf

电泳技术在农作物种子纯度检验中的 应用及需要解决的问题 李霞辉 ? 苏 ? 萍 ( 黑龙江省农业科学院? 哈尔滨? 150086) 提? 要? 电泳技术在农作物品种纯度检验上有很大应用价值其中蛋白质 PAGE 电泳分辩 率高, 设备简单, 成本较低, 非常适合做种子纯度检验本文着重概述了在实用化方面需要解 决的几个问题 关键词? 纯度检验? 电泳? 实用化问题 ? ? 70 年代以来, 电泳技术开始用于品种鉴定和纯 度检验, 并得到迅速发展近半个世纪以来, 电泳 技术一直围绕提高分辨率、灵敏度、缩短电泳时 间、简化操作程序和扩大应用范围, 不断进行改 进淀粉凝胶电泳 ( SGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) 、SDS- PAGE 等电聚焦电泳 ( IEF) 、浓度 梯度凝胶电泳 (PORO- PAGE) 、双向电泳 (2D) 、 毛细管区带电泳 ( CZH) 等在品种鉴定和纯度检验 中表现出各自的特点即使同类电泳方法也可因选 用的缓冲系统、pH 值、凝胶浓度及比例或提取剂 的不同, 衍生出众多的改进的电泳方法, 这些方法 因研究目的、对象不同都有特定的使用范围到 80 年代蛋白电泳的主要新成果,一是 IEF 法有新突 破, 做成超薄层薄胶, 并用滤纸条代替大量的缓冲 液的半干技术及干胶, 大大提高了分辨率,缩短电 泳时间, 避免谱带的畸变; 二是计算机软件功能的 开发, 使电泳图象分析技术取得很大进展,使大量 电泳图谱得以长期保存, 图谱数据处理自动化, 可 以合理扣除背景, 准确测定相对含量、分子量、等 电点, 以及在屏幕上进行图谱比较。

ISTA 认为电 泳在品种纯度检验上有很大的应用价值, 是近期的 主攻方向 1? 电泳在作物品种纯度检验中的应用 ? ? 电泳方法基本可以分为贮藏蛋白电泳和酶电泳 方法两大类 1. 1? 贮藏蛋白电泳技术? 贮藏蛋白是种子的主要 成分, 又是基因的直接产物几乎所有作物种子贮 藏蛋白都具有特异性, 他们在许多位点被编码, 在 种子中大量存在, 又容易分离和提取, 因此蛋白组 成的特异性为品种鉴定和纯度鉴定提供了基础为 表征作物基因型提供了有效而简便的手段其中 PAGE 方法可获得广泛多态性, 属于此类的有 ? ISTA 标准参照方法 ( 1986 年) , 可显示 40 多条小 麦醇溶蛋白和 20 多条大麦醇溶蛋白谱带Ccoke ( 1986 年) 用该法将 155 个小麦品种中的 137 个鉴 定出来 Bushuk 和 Zillman ( 1978 年) 乳酸铝缓 冲系统 PAGE 方法, 已推荐写入 ICC B 标准 付 宾孝建立的甲酸系统醇溶蛋白 PAGE 方法分析黑龙 江省 30 年代以来的 100 多个小麦品种品系, 均表 现出品种间差异性新克旱 9 和克旱 9是从同一组 合后代选育出来的两个亲缘关系密切的品种, 醇溶 蛋白组成的差异在电泳谱带得到表达。

∀中国专利 第 70041 号方法 ( 1992 年) 已在河南、内蒙、吉林 等地推广应用 1. 2? 酶电泳技术 ? 同工酶也是基因表达的产物, 同样可以作为遗传标记同工酶电泳不仅广泛应用 于物种进化, 亲缘关系分析, 杂种优势预测, 作物 抗病特性鉴定等方面在检验种子纯度方面也进行 了很多研究国内陆士伟 ( 1982)用同工酶 PAGE 测定杂交水稻种子纯度取得进展李卓杰 (1992) 收稿日期: 1996- 10- 29 #41#中国农学通报? 1997 年? 第 13卷 ? 第 5期 建立了 IEF 同工酶检验种子纯度的技术杨太兴 ( 1986) 建立了 酯酶同工酶和过氧化物酶电泳检验 玉米种子纯度技术由于同工酶电泳具有明显的组 织器官特异性和阶段发育特异性, 酶活性又受到多 种因素影响, 对其取样部位, 时间以及整个测定过 程要求非常严格, 且多态性位点不够多, 并要求有 同等活力的酶谱样品作对照, 加之在自交系内 ∃ 酶 谱纯度% 不纯现象比较普遍, 酶谱的识别变得复杂 化, 使酶电泳方法在应用中受到限制 2? 电泳技术在实用化方面需要解决的问题 ? ?蛋白质 PAGE 电泳分辨率很高,容易找出基 因型的特异性, 一般 1~ 2d 可检出, 设备简单, 成 本也较低, 非常适合做纯度检验。

但至今在实际应 用中, 未能作为大规模品种鉴定和纯度鉴定手段, 也未正式纳入种子检验规程, 仅作为参照依据在 实际应用中还有许多有待需解决的问题 2. 1? 尽快研究和建立适合玉米、水稻等作物的简 便、快速、易于推广的 PAGE 蛋白电泳方法? 各种 作物蛋白质组成、特性不同, 只有对其蛋白组成电 泳特性进行系统的研究,才能建立理想的电泳方 法纯度鉴定工作是大量的, 时间性很强简便快 速和便于在基层广泛推广是很重要的, 应与新品种 指纹登记, 品种法权保护, 遗传分析的电泳方法有 所区别的 2. 2? 尽快将经过验证的电泳方法写入种子检验规 程, 促进电泳方法的标准化? 每种作物建立一种适 合的 PAGE 蛋白电泳标准方法是可能的, 这对种子 的真实性和纯度检验工作将带来很大方便 2. 3? 电泳数据处理的标准化和自动化? 在对电泳 操作程序规范化的同时, 还必须解决电泳数据的标 准化问题, 因为尽管规范了的电泳方法, 其谱带组 合、条带数、位置是相对稳定的, 但仍有种种因素 影响电泳谱带的迁移率, 不可能完全一致,会发生 一定变异, 而且纯度检验至少在 100~ 200 粒以上, 往往不可能在同一块胶板电泳。

为使实验数据有可 比性, 必须进行系统的校正工作, 即进行数据的标 准化蛋白谱带定位和标准化是实现数据处理自动 化的重要前提 H. D.sapistein 及 W.Bushuk ( 1985)在以 Rm50 单条参考谱带进行小麦蛋白电泳数据标准化 的基础上, 创立了三带法对图谱进行非线性三点校 正, 用最少的重复实验得到了低于 0. 08Rm 单位的 平均标准误差我国祁国中等人开展了玉米品种鉴 定数据处理的研究总之, 应尽快实现标准化, 才 能使电泳图谱的比较和描述能够实现简单化和自动 化 2. 4? 蛋白谱带的命名 ? 由于不同国家, 不同实验 室采用不同的命名系统, 妨碍了信息的交换和品种 的比 较Wrigley ( 1982)建 立 相 对 迁 移 率 法, Shewry ( 1979) 建立了图谱名法我国张建华等人 建立了三位码酶谱编码法等应使谱带命名规范 化 2. 5? 标准样品的来源 ? 常规电泳品种鉴定, 需要 选择一个确定的标准样品与之进行比较而标准样 品征集比较困难, 如果不能保证标准品种的真实性 并有稳定的来源, 就无法保证鉴定结果的可靠性 2. 6? 电泳谱带的整齐性? 自交作物 ( 小麦、大麦、 燕麦、普通水稻) 仅在原始品种和地方品种中可能 出现品种内的多样性, 即一个品种不只有一种蛋白 电泳图谱; 异交作物 ( 黑麦、蚕豆等) 均表现品 种内部的异质性, 一般分多态性品种。

中等多态性 品种和低多态性品种三类;! 杂种一代 ( 杂交玉 米、杂交水稻) 情况比较复杂, 电泳谱带的不整齐 性可能来自: 去雄不完全或自交系亲和性不完全, 或改良单交种如果玉米单交种亲本自交系制种产 量低于 250kg/667m2在生产上难以接受, 多用改良 单交种来提高制种产量, 1992 年统计改良单交种品 种面积已达 200 万 hm2, 以占杂交玉米的 10% 可 见仅从 1~ 2 条谱带的差异否定为同一品种, 依据 不够充分, 因为也可解释为品种内的不同生物型, 贮藏蛋白组分的不同等位基因的表达, 或姊妹系谱 带的表达这些都给纯度鉴定带来困难为此, 应 掌握和熟悉有关品种的遗传背景知识 主要参考文献 1? 傅宾孝. 作物学报, 1993, ( 2) : 185~ 187 2? 颜启传. 作物学报, 1992, ( 1) : 6~ 67 3? 周展明, 等. 郑州粮食学院学报, 1992, ( 3): 23~ 28 4? Bushuk W, Zillman R R Can J. Plant sci, 1978, 58&505 5? Cooke R J, et al. Seed Science and T echnology,? 1986, 14&693~ 704 #42#Chinese Agricultural Science Bulletin? 1997? Vol. 13? No. 5 。