外源蛋白在Pichia中表达优化.doc

重组蛋白在Pichia酵母中的优化表达1.外源蛋白在Pichia中优化表达1） 外源基因本身特性AT含量：过高AT含量的基因经常不能有效表达，其中局部高AT含量影响更大，一是 因为高AT含量基因很可能存在导致转录提前终止序列和PolyA化序列，优化的AT含量为 30-53%有利于表达；密码子选择：基因中含有稀有密码子经常因为翻译效率低影响基因表达效率，Pichia酵 母编码基因的平均AT含量为58%,使用酵母高偏好密码子有利于表达量提高；mRNA5MJTR和亍・UTR： mRNA5MJTR的序列组成和长度应当适当，AT富余，ATG 起始密码子附近应避免ATG序列；mRNA二级结构：基因应去除可能影响mRNA稳定性和有效翻译的序列，如潜在的发 夹结构，转录终止序列，内含子识别序列；2） 表达载体选择胞内表达和胞外（分泌）表达载体：分泌载体有利于蛋白纯化载体启动子：强启动子通常有利于高效表达，AOX1为甲醇诱导启动子，pGAP为三磷酸甘油脱氢酶 （GAPDH）诱导启动子信号肽：最常用的a -factor信号肽，Intivrogen的PPIC系列质粒载体均使用该信号肽当使用 该启动子信号肽剪切效率不高时，可考虑使用其他信号肽，如PHO1信号肽（PHIL-S1系列 载体），SUC2信号肽，MMP信号肽。

还可以考虑使用基因本身信号肽外源基因的拷贝数：通常认为，外源基因的高拷贝数有利于提高表达水平，但是高拷贝数与高表达水平的対 应关系经常不一致有些外源基因即使单拷贝也能得到较高的蛋白产量，提高拷贝数对表达 水平的提高没有明显作用，很多外源基因，提髙拷贝数可以显著提髙蛋口产量也有极少 数情况，高拷贝数对表达水平有不利的影响因此，我认为在单拷贝条件下，外源基因表达 水平本身较高吋，提高拷贝数意义不大，对于表达水平相对较低或很难表达吋，提高拷贝数 应该有显著的作用化学转化法比电转化法使Pichia细胞产生多拷贝转化子的频率耍高，但是电转化法配合 G418抗生素筛选髙拷贝数简单易行PPICZ a载体比PPIC9K载体更容易筛选到高拷贝数 的转化子，而II更有利于重组基因片段的操作详细，资料请参阅Intivrogen公司的载体说明 书3） 蛋白产物稳定性外源蛋白经常因为酵母菌株口身分泌的蛋白水解酶或其他未知因素作用而使产物降解, 有如下方法可以减少其影响：（1） 使用蛋白酶缺陷型酵母菌株如SMD1168 （his4 pcp4）, SMD1163 （his4 pcp4 prbl）；（2） 在培养液中加入一些一些富含氨基酸的组分如酪蛋白水解产物，YP等，提供给酵 母细胞蛋白酶过量的底物而减少目的蛋白的降解作用；（3） 调节溶液PH值，抑制蛋白酶的水解活性；（4） 在表达产物上清收集和产物纯化时加入一些蛋白酶抑制剂，如Casamino acids,, Cock tail, PMSF, EDTA等，可有效降低蛋白的降解作用；4） 表达条件和方法高菌体细胞密度对应高水平表达，因此发酵将有利于大量表达蛋白产物。

发酵比摇瓶培 养一般可以提高表达水平10倍以上很多〉百毫克/升的高表达都是通过发酵获得的酵母表达菌株可以有两种甲醇利用表型，Mut+利用甲醇较快，Muts利用甲醇较慢多 数人倾向于使用Mut s菌株，因为其利用甲醇较慢，经常比野生型Mut+菌株获得更高的表 达水平，尤其是在摇瓶条件下培养另外，培养液中一些过量或不适当的成分以及分泌的外源蛋白都有可能对宿主细胞产生 毒性作用而影响表达例如，过量甲醇在培养基中聚集对酵母有毒害作用，使其产生更多的 自身杂蛋白，甚至可能导致酵母大量死亡［参4, 6］5) 酵母表达菌株本身的缺陷酵母是一种低等的真核生物，其mRNA的翻译和翻译后修饰的能力有限，对于一些结 构复杂而且分子量较大的蛋白表达经常不是很有效一些高等生物的外源蛋白虽然可以在酵 母中高表达，但是蛋白的功能和活性不太理想，尤其是一些重组抗体蛋白外源蛋白在酵母中表达经常有不可预知的糖基化作用，致使表达蛋白的表观分子量有所 增大，而且可能对蛋白的生物学活性有一定影响糖基化包括N —糖基化和O —糖基化，产 生N—糖基化的一个特异性识别序列为Asn-X-Ser/Thr,而0—糖基化尚未找到特异性的识 别序列。

值得注意的是，不能因为一个外源蛋白在其本身宿主(native host)中没有糖基化 而推测它在Pichia中表达不会被糖基化另外，其它一些未知的因素也可以导致外源蛋白在Pichia中的表达量较低或没有表达 参考文献1：1. 外源蛋白再巴氏毕赤酵母中高效表达的策略，吉首大学学报,2001,22(3): 40-44;2. Strategies tor ojptimal synthesis and secretion of heterloguos proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, Gene, 1997, 190: 55-62;3. Heterloguos protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, FEMS Microbiology Reviews, 2000,24: 45-66;4. Towards molecular farming in the future: Pichia pastoris-based production of singe-chain antibody fragments, Biotechnology and Application Biochemistry, 1999, 30: 117-120;5. In vitro production of recombinant antibody fragments in Pichia pastoris, Forum in Immunology, 199& 74th edition, 599-603;6. Qualigy and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast, Expression Vector, Cunent Opinion in Biotechnology, 1996, 7: 525-530;2.基因改造和密码子优化文 献蛋白、载体、 表达方法基因优化方法效果123KD,酵母偏爱密码子，重壳PCR技术， 全基因合成23KD,2PPICZa A, 50KD密码子部分替换，主要SRTGPL, 少量ACV351aa, PUCI9 载体，GS115 菌株，Muts全基因合成表达量提高为100mg/ml4PPIC9,优化编码Arg的密码子，3个CGG 和一个CGA,定点突变为AGA提高37倍，无mRNA水平 差界5pUC19 和 pPICZ aCTG被替换编码Ser替换,GC含量产量为 500-600 U/L*h,在B载体，60KD降为46%P. past or is r|,比 在 S. cerevisiae中表达暈高10倍 以上682KD, PPICZ a A,KM71菌株，摇瓶(1) 全基因优化，完全去除Pichia的 稀有密码子，AT含量从76%降为 54%；(2) 去除6个潜在的N糖基化位点；优化前因为mRNA提前终 止而无产物，优化后髙水平 分泌蛋白7Pichia中GC含量42%,密码子使 用频率表和高表达密码子表9PPIC9, Sall, GS115 使用摇瓶和发酵；丰度＜10%的密码子被替换；去除五 个以上重复AT、GC对(潜在的发 夹结构)；构建的EI和EI-MCS基 因，前者去除了载体信号肽清除位 点后12bp的MCS碱基序列；优化前表达暈为25mg/L, 表达量提高10・20倍；密码 子优化表达量仅提高2倍；EI是EI+MCS的10倍，而 mRNA水平类似，说明优化 在转录后翻译过程；10PPICZ a A ,PPIC9KSacI, KM71发酵力口入 Casamino acids去除两个polyA位点附近的保守 AATAAA序列；三个AT富含区含 量从64%降为50%并作相应的密码 子优化；低AT含量区域如(GaS)3连 接区替换为偏好密码子；表达量提高5倍，达到10mg/L,1162KD , PPIC3 和PPIC9, KM71 菌株， 发酵(1) 去除ATG起始密码子上游19bp 的序列，包含儿个假的ATG序列；(2) 全基因优化,使用Pichia偏好密 码子，去除可能的发夹结构等；从低于检测极限到 250mg/L,只作优化1的酶 活性比优化1和2要高5— 10倍，产量无差异1258KD, pHIL-D2 和 pPIC9, GS115 和 SMD1168菌株，化 学转化法全基因合成，附序列，76%的AT 含暈降为？，Pichia中表达量不高，可能 是因为低转录水平，5,非翻 译区的发夹结构，且与 folding and transport 相关13150KD, pHIL-D2, SacI, GS115,发酵全基因优化，AT含量从76%降为 53%,且降低了局部的AT含量，附 密码子使用表；可达llg/L的表达量，纯化 后可得0.52g/L的纯蛋白参考文献2：1. 重组人白细胞介素11,生物化学与生物物理学学报，2001, 33 (6)： 659-6642. 人工合成黑曲霉基因，生物工程学报，2001, 17 (3)3. 人工合成表皮生长因子基因，中国生化与分子生物学报，1998, 14 (5)4. 高效表达具有生物学活性植酸酶，中国科学C辑，1998.6, 14 (3)5. Design, total synthesis, and functional over expression of the Candida nigosa lipl gene coding for a major industrial lipase, Protein Science, 199& 7: 1415-14226. High-Level Expression of the Malaria Blood-Stage Vaccine Candidate Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen 1 and Induction of Antibodies That Inhibit Erythrocyte Invasion, Infection and Immunity, 2002, 70(8): 4471-67. 毕赤酵母密码子用法分析，生物工程学报，2000, May, 16 (3)9. Optimization of the Expression of Equistatin in Pichia pastoris, Protein Expression andPurification, 2002, 24:18-2410. Gene optimization is necessary to express a bivalent anti-human anti・T cell immunotoxin in Pichia pastoris, Protein Expression and Purification, 2002, 25(2): 270-282;11 ・ Optimization of the Prod。