【最新】2 水解酶及氧化还原酶组织化学.docx

 水解酶及氧化还原酶组织化学 原理及方法 水解酶 hydrolases 指催化底物发生水解反应的酶类 例如:磷酸酶类、酯酶类等 AB＋H 2O AH＋BOH  磷酸酶类 磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称 水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联 而显色 碱性磷酸酶：在 pH9.2-9.4 表现为最大活性 酸性磷酸酶：在 pH5.0 显示最大活性 显示法：• 金属沉淀法• 偶氮耦联法 碱性磷酸酶alkaline phosphatase ,AKP、ALP 在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解 磷酸和 R 能用组化方法捕获• 钙钴法：捕获磷酸• 偶氮耦联法：当 R 为萘酚衍生物时，捕获 R• 二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察 激活：金属离子—Mg 2+ 、Mn 2+ 、Zn 2+ 、Co 2+  抑制：Tetramisol(四咪唑)、各种醇类、L-半胱氨酸  钙钴法（金属沉淀技术 ）Gomori-Takamatus 法 原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生沉淀• β-甘油磷酸钠（底物）─→磷酸离子• 磷酸离子+Ca 2+ ─→磷酸钙（不可见）• 磷酸钙+Co 2+ ─→磷酸钴（不可见）• 磷酸钴+S 2- ─→硫化钴（不溶，可见） 条件：pH9.4 作用液：• 2%巴比妥钠• 3%β-甘油磷酸钠• 2%无水氯化钙• 2% MgSO4.7H2O 步骤：• 新鲜恒冷箱切片，8μ 不固定直接进作用液 FCa（氯化钙 Formalin）固定 5'-2h，4℃，固定后蒸馏水洗• 作用液 10-60’，37 ℃（视组织而定）• 流水 5’• 2%硝酸钴 5’• 蒸馏水洗• 1-2%硫化铵 1’（ *硫化铵需新鲜配制）• 蒸馏水洗• 甘油明胶封 结果： 黑色的颗粒状沉淀 对照：• 去底物（以双蒸水替代 β-甘油磷酸钠） ，结果阴性• 进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使酶失活 注意：组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色沉淀，应鉴别（铁反应） AKP 主要存在于• 物质交换活跃处：肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、肝毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部的内皮• 内质网、高尔基复合体、吞饮小泡肠上皮的溶酶体、中性粒细胞的中性颗粒，平滑肌细胞膜 是细胞膜的标志酶之一 骨肉瘤内有丰富的 AKP 偶氮耦联法 原理：磷酸萘酯经酶水解放出萘酚，立刻为重氮盐捕获而成为有色不溶的偶氮染料。

α-萘酚磷酸钠 α-萘酚α-萘酚 重氮盐 （固蓝 RR） 偶氮染料 Lojga 改良 Burstone 偶氮耦联法 作用液• 萘酚 AS-SI 磷酸钠• DMSO(二甲基亚砜)• 六偶氮对品红 A 液：盐酸对品红 400mg，蒸馏水 8ml，浓盐酸(36%)2ml 混合溶解过滤 B 液：4％亚硝酸钠液 临用前 A、B 液等量混合• Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2~9.2） 步骤：• 小块组织用液氮骤冷，恒冷箱切片 固定 FCa 5 分钟，4℃，固定后蒸馏水洗 不固定• 作用液 5-60’，37℃或室温• 蒸馏水洗• 4%甲醛固定 15’-2h，室温• 自来水洗，蒸馏水洗• 1%甲基绿（氯仿洗过）5-10 分钟，蒸馏水洗• （1）甘油明胶封• （2）丙酮-丙酮甲苯- 甲苯-DPX 封 结果： 酶活动处出现红色无定形的沉淀，核呈蓝绿色，对比明显 *重氮盐也可用固蓝 B 盐 , 这种酶的反应活性部为紫黑色，核的对比染色应改用核固红或中性红  钙钴法和偶氮耦联法比较 钙钴法操作简单，但会出现假阳性现象 偶氮耦联法的保温时间短，方法比较灵敏；在正常组织中无萘酚，不会出现假阳性，故不需对照切片；反应产物为偶氮染料，较磷酸钙更难溶解，定位好，不易扩散，图象清晰，并可控制反应深度  酸性磷酸酶（ACP）  ACP 是在酸性范围里水解磷酸单酯，游离出磷酸的酶 最适 pH 为 4.5-5.5 Gomori 铅法 作用原理同 AKP。

因磷酸钙在酸性 pH 溶解，故用硝酸铅作为捕获剂，再用硫化氢直接把磷酸铅转变为硫化铅，最后形成棕黑色硫化铅沉淀 激活剂：Mn 2＋ 抑制剂：氟化钠、磷酸根离子 对照：去底物；抑制酶 作用液• 巴比妥醋酸缓冲液（PH5.0）　　20ml• 3%β-甘油磷酸钠　　　　　　　2ml• 硝酸铅　　　　　　　　　　　 24mg• 用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅，然后再加入 3%β-甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其 PH 值，如不足或高于，都应调校至 5.0  步骤• 恒冷箱冷冻切片，附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干 30 分钟后，用纯丙酮固定 5-10 分钟• 蒸馏水轻洗• 将切片于作用液中孵育 30-120 分钟（37℃） • 蒸馏水冲洗 1 分钟• 1%冰醋酸水溶液浸洗 30 秒钟• 蒸馏水冲洗 1 分钟• 1%硫化铵水溶液处理 1 分钟• 流水冲洗后再入蒸馏水洗• 核固红染核 5 分钟• 流水洗 5-10 分钟• 常规脱水、透明并封固 结果：细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色  偶氮耦联法 作用原理同 AKP 因为许多重氮盐在 pH5.0 时，不能与 α-萘酚偶联；或在 pH5.5 时虽可偶联，但水解的速度大于耦联速度而造成弥散。

而萘酚 AS-BI 磷酸钠，与六偶氮对品红偶联，反应产物不溶，可获得正确的定位，鲜红色沉淀表明酶活性的位置 经氯仿提取过的甲基绿为理想的复染染料，选择性地染胞核，而不影响反应产物的颜色 ACP 分布极广，遍布各组织• 主要存在于细胞的溶酶体内，为溶酶体标志酶• 内质网，胞质 骨巨细胞瘤内有丰富的 ACP 5’-核苷酸酶 （5’-Nucleotidase,5’Nase） 催化核糖核苷和去氧核糖核苷在 C-5 位置水解磷酸酯 反应式： 酶活性的显示是由底物中的腺苷酸水解后释放的磷酸基被重金属捕捉 激活剂：Mg 2+，Mn 2+ 抑制剂：NaF(0.1M) ，硼酸钠(0.08M)，Ni(10-3M)  5’Nase 有同工酶，最适 pH 有酸性、中性和碱性中性最适 pH7.5 方法：铅法 酶分布较广泛，所有的生物细胞膜包括微生物在内，均具有 5’-Nase, 是细胞膜的主要标志酶 肝、骨、肌、肾上腺髓质、脑组织中酶活性较高 葡萄糖-6-磷酸酶 glucose-6-phosphatase,G6Pase G6Pase 是具有水解活性和变位活性的多机能酶组化检查法是与其水解活性有关。

6-磷酸葡萄糖 + H2O──→ 葡萄糖+磷酸磷酸+Pb 2+ ──→ 磷酸铅 G6Pase 在 pH6 活性最强，在 pH8 最稳定，而在 pH5 易变性组化反应用pH6.5-6.7. 抑制剂：氟化物，Zn 2+,CN-,四氧嘧啶 短时低温丙酮固定或不固定 酒精固定，石蜡包埋，G6Pase 完全被抑制 方法：铅法 结果：酶活性处棕黑色硫化铅沉淀 酶定位于内质网，为内质网的标志酶以肝、肾、肠粘膜、精囊腺、前列腺为强阳性 意义：此酶常用于诊断糖原贮积病Ⅰ型（酶缺乏）癌变过程中 G6P 不断减少或消失 腺苷三磷酸酶adenosin triphosphatase，ATPase ATPase 只作用于磷酸与磷酸之间的高能键，水解三磷酸腺苷为二磷酸腺苷，同时释放大量能量 方法：金属沉淀法• 钙钴法用来示肌球蛋白 ATP 酶，也可示线粒体的以及与膜结合的 ATP 酶• 铅法用于示膜结合的 ATP 酶，也可示线粒体酶 酯酶 属于羧酸酯水解酶• R-COOR`+ H2O ＝ R-COOH + R'OH 分类• 非特异性酯酶：水解短链脂肪酸的酯• 脂酶：水解长链脂肪酸的酯• 胆碱酯酶：水解胆碱的酯键 非特异性酯酶nonspecific estarases 是一类分解含短链（C2-C4）低级脂肪酸酯，并且没有底物特异性的酶，能水解 α萘酚醋酸。

 最适 pH5.0～8.0 方法：偶氮耦联法• 通常用醋酸萘酚或萘酚 AS 衍生物作底物，在酶的作用下，释出萘酚，与固蓝 B 或六偶氮对品红偶联成蓝棕色或不溶的偶氮染料 应用• 此酶定位于溶酶体、内质网，在肝、肾、胰和小肠酶活性高• 单核巨噬细胞含酶最丰富• T 淋巴细胞局限性点状阳性，B 淋巴细胞阴性• 用作髓性白血病的鉴别诊断： 胆碱酯酶 乙酰胆碱脂酶(acetycholinesterase，AchE)• 水解乙酰胆碱• 分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动终板） 、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路• 最适 pH7.5~8.0 胆碱脂酶(cholinesterase，ChE)• 水解胆碱的酯• 见于血清、胰、唾液腺内• 最适 pH8.0~8.5 抑制剂• 毒扁豆碱，DFP（二异丙基氟磷酸）抑制 AchE 和 ChE• 四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制 ChE• BW284C51 特异性抑制 AchE 方法：亚铁氰化铜法 染色原理 作用液• 碘化乙酰硫代胆碱（底物） 5.0mg• 0.1M 顺丁烯二酸缓冲液（pH6） 6.5ml• 0.1M 柠檬酸钠 0.5ml• 5M 铁氰化钾 1.0ml• 30mM(0.75%)CuSO4 （捕捉剂） 1.0ml• 蒸馏水（或抑制剂） 1.0ml  作用条件• 温度 37℃或室温；时间 30～60min  用 0.1M 蔗糖＋ 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。

 氧化还原酶 oxidoreductases  细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的 氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应 脱氢酶 脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系 不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶 I、辅酶 II（NDAP）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受氢体还原显色，从而达到定位目的 组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种 脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体  四唑盐法的基本原理• 琥珀酸脱氢酶succinate dehydrogenase，SDH  不需辅酶琥珀酸+受氢体 ＝＝＝ 延胡索酸+ 还原的受氢体 方法：硝基蓝四唑法 Pearson1958 最适 pH7.6~8.5 抑制剂：丙二酸盐（竞争抑制） ，磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制） ，凡与-SH 基化合的作用剂皆抑制其活性  作用液的配制：• 琥珀酸钠• 磷酸缓冲液• NBT（硝基蓝四唑）*• DMSO（二甲亚砜）*NBT 先溶于 DMSO 中，再加入上液 步骤：• 新鲜恒冷箱切片• 作用液 15-35 分钟，25℃• 盐水洗• Fca（氯化钙 Formalin）固定 10 分钟• 80%酒精 5 分钟• 甘油明胶封固 结果：酶活性表现为蓝紫色沉淀 SDH 仅位于线粒体中，可作为线粒体的标志酶 含 SDH 活性高的组织为：心肌、肾小管上皮和肝细胞 乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase,LDH  需辅酶乳酸盐+NAD ＝＝＝丙酮酸盐+NADH+H +（辅酶Ⅰ） （还原型辅酶Ⅰ） 四唑盐接受还原型辅酶 I 的氢而被还原为深色不溶的甲 沉淀。

 最适 PH7.4 方法：LDH 四唑盐法 LDH 是糖原分解的酶系 肝、骨骼肌中酶活性强 同工酶 LDH1 为心型，与有氧代谢有关 。