抗菌检测知识简介.docx

日本国家标准JIS Z 2801:2000抗菌制品 抗菌性能的检测与评价引言本标准是为规范抗菌制品抗菌性能的评价方法制定的，并于1998年12月在“生活相关 新型（抗菌）功能制品会议”的报告上公布的，（亦称“抗菌制品的指导方针”）本标准规定 了作为抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的测试方法抗菌制品的其他重要性能，包括安全 性、性能持久性以及制品标识则请参考“抗菌制品的指导方针”1. 范围本标准规定了抗菌制品（包括中间制品）表面抗细菌活性及效果的测试方法备注：本标准暂不包括抗菌制品的其他功能，如抗真菌性能和除臭性能2. 规范性引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准JIS K 0950灭菌塑料培养皿JIS K 0970微量移液器JIS K 3800二级生物安全柜JIS K 8101 乙醇（99.5）JIS K 8150氯化钠JIS K 8180 盐酸JIS K 8263 琼脂JIS K 8576氢氧化钠JIS K 9007磷酸二氢钾JIS K 9017磷酸氢二钾JIS L 1902纺织品抗菌性能的检测与评价JIS R 3505玻璃量具3. 定义本标准中用到的主要术语定义如下：a） 抗菌抑制制品表面细菌生长的状态。

b） 抗菌整理为获得抗菌效果而进行的处理c） 抗菌制品实施抗菌加工后的制品d） 抗菌活性值抗菌制品和未处理制品在接种细菌培养后，得到活菌数目对数的差值 参考资料：JIS L 1902的抑菌（静菌）活性和本标准中的抗菌活性概念相同e） 抗菌效果根据抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果4. 抗菌效果按本标准的测试方法，抗菌制品的抗菌活性值应不小于2.0，超过2.0的数值若取得各 相关单位同意也可采用5.试验方法5.1纺织制品测试方法 抗菌纺织制品的检测方法根据JIS L 1902 : 8 （定量法）测定5.2塑料等制品的测试方法 适用于非纺织制品，如塑料制品、金属制品、陶瓷制品等根 据纤维制品的形状和用途也可采用5.1的方法测试5.2.1试验菌种试验所采用的菌种见下，需采用下述细菌中的每一种：a） 金黄色葡萄球菌b） 大肠杆菌试验所用菌株举例如表1所示如从有别于表1的机构获取菌株，则该机构必须是国际 菌种保藏中心（WFCC: World Federation of Culture Collection）的成员或日本菌种保藏协会 （JSCC： Japan Society of Culture Collection）的成员，并且菌株必须和表 1 相同。

表1试验所用的菌株细菌种类菌株号保藏机构金黄色葡萄球菌ATCC6538PFDA209PIFO 12732美国菌种保藏中心 美国食品药品监管局（FDA） 发酵研究所大肠杆菌ATCC 8739IFO 3972美国菌种保藏中心 发酵研究所5.2.2化学试剂、材料和器材除非另有说明，本试验方法所用的化学试剂、材料和器材如下所示乙醇（c2h5oh）符合JIS K 8012规定的一级或更高牛肉膏微生物试验用蛋白胨微生物试验用氯化钠符合 JIS K 8150纯化水符合日本药典第十三次修订版要求琼脂符合 JIS K 8263酵母浸膏微生物试验用胰蛋白胨微生物试验用葡萄糖微生物试验用酪蛋白胨微生物试验用大豆蛋白胨微生物试验用卵磷脂微生物试验用非离子表面活性剂聚山梨醇脂（吐温80）磷酸二氢钾 符合JIS K 9007磷酸氢二钾 符合JIS K 9017氢氧化钠 符合JIS K 8576盐酸 符合JIS K 8180棉塞等 棉制，或硅胶、金属、莫顿塞等白金接种环 端部直径约为4mm环干热灭菌器 可在160-180°C工作蒸气消毒锅 可保持121C并在103KMPa保压安全柜 符合JIS K 3800的规定洁净台 微生物试验用移液管 符合或等同于JIS K 0970或达到JIS R 3505中规定的A级培养箱 温度控制精度±1°C培养皿 玻璃材质，内直径90mm或遵照JIS K 0950中90A或90B规定洗脱袋 微生物试验用Stomacher 微生物试验用薄膜 不影响微生物生长并且不吸水的材料，厚度无明确规定，但要求附着性好5.2.3灭菌方法a） 干热灭菌 放入干热灭菌器在160-180C下灭菌30-60分钟注意：灭菌后，如果棉塞或包装纸不小心被水弄湿，相关器皿请不要继续使用。

b） 高压蒸汽灭菌 在灭菌消毒锅中注入水，将待灭菌的物品装入筐中，并放于消毒锅架子 上，盖紧，加热，在121C或103Kpa下保持15-20分钟停止加热，然后使其自然冷却到 100C以下，打开排气阀放出蒸汽，打开盖，取出灭菌物品必要时放入洁净台或安全柜中 冷却为避免灭菌锅受培养物质或化学品污染，用中性洗涤剂洗涤灭菌锅，并用水冲洗干净c） 火焰灭菌将待灭菌的物品置于由燃气或酒精燃烧而产生的火焰上，如对于白金接种环应 加至红热，对于试管则在火焰上烤2-3秒钟d） 器材准备用碱性或中性洗涤剂洗刷试管、烧瓶等器具，充分冲洗，干燥后干热灭菌或蒸 汽灭菌后使用5.2.4培养基等使用下列培养基，如商品培养基和此处介绍的培养基组成相同，则也可使用商品培养基a） 营养肉汤 将3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠溶于1000ml蒸馏水或去离子水中， 放入锥瓶、混合、充分溶解后，用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为7.0-7.2 （25C），使 用前，将其分别注入试管，加上棉塞，然后进行高压灭菌若配好后不立即使用，要在5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的培 养基b） 营养琼脂 将5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠和15.0g琼脂，加入1000ml蒸馏 水或去离子水中，置入锥瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。

用盐酸溶液或氢氧化钠溶 液调节其pH为7.0-7.2 （25C），加上棉塞，然后进行高压灭菌若配好后不立即使用，要在5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的培 养基c） 平板计数琼脂 将2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15g琼脂加入到1000ml 蒸馏水或去离子水中，置于锥瓶中混合并在沸水浴中充分溶解然后用盐酸或氢氧化钠 溶液调节pH为7.0-7.2 （25C），加上棉塞，然后进行高压灭菌若配好后不立即使用，要在5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的培 养基d） 斜面培养基 将6-10ml加热溶解的营养琼脂切注入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌灭菌后的试管在洁净间中以和水平面成15°倾角放置来让其凝固若配好后不立即使用， 要在5C〜10C下保存如没有冷凝水出现，将其溶解，并凝固后使用不要使用配制 完存放一个月或以上的斜面培养基e） SCDLP肉汤 将17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠和2.5g磷酸氢二钠、2.5g葡萄糖和1.0g卵磷脂加入到1000ml蒸馏水或去离子水中，置于烧瓶，加7.0g非离子表 面活性剂以促进溶解用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2 (25°C).使用此 培养基时，将其分散到试管中或烧瓶中，将棉塞塞上，然后用高压湿热法灭菌。

若配好后不立即使用，要在5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的 SCDLP肉汤f) 磷酸盐缓冲溶液 将34.0g磷酸二氢钾放入容量瓶中，加入500ml蒸馏水或去离子水已 将其充分溶解，用氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2(25C)，然后加入蒸馏水或去离子水 将溶液定容到1000ml使用时，取部分溶液到试管或烧瓶中，塞上棉塞，并加入7.0g 非离子表面活性剂用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2(25C)使用此溶液时， 将其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌若配好后不立即使用，要在5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的磷 酸盐缓冲溶液g) 磷酸盐缓冲生理盐水溶液用浓度为0.85%的氯化钠溶液稀释磷酸盐缓冲溶液至体积比800倍当使用此溶液时将 其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌若配好后不立即使用，要在 5C〜10C下保存不要使用配制完存放一个月或以上的磷酸盐缓冲生理盐水溶液5.2.5细菌的保藏在无菌条件下转接试验细菌，必要时要使用生物安全柜一手同时拿着保 藏菌和5.2.4 d)的待接种斜面培养基，另一手拿接种环，并用拿接种环的手拔开试管的橡胶 塞。

在火焰上对试管口灭菌，并对接种环灭菌，然后将接种环的头部放入斜面培养基的冷凝 水中冷却用接种环从细菌生长面上刮下细菌，并用划线法接种到斜面培养基上用火焰再 次对试管口部进行消毒并塞上棉塞用火焰对接种环进行消毒在35±1C下对接种后的斜 面进行24-48小时培养，然后在5-10C保藏一个月内将其接种到新的斜面(以此类推)， 但接种次数从菌种中心得到的细菌算起不应超过10代如保存时间达到或超过一个月，不 可进行继代培养备注：如图1将接种环端部插入冷凝水中分散细菌，用接种环从底部拉一条线到上部， 或将接种环再次插入到冷凝水中画一条折线到顶端注意：如细菌保藏机关提供的细菌经过冻干法或冷冻法用于长时间保存，从原始保存 菌制备保藏细菌的次数也应包括在细菌培养代数之内如使用此保藏菌株，则其继代培养次数不应超过10减去保藏菌的代数5.2.6试验操作细菌操作必须在无菌条件下进行，试验菌注意不能对试验操作人员、设备和 环境构成污染，如有需要则使用生物安全柜a）细菌前培养用接种环从5.2.5的保藏细菌的培养基中取1环细菌接种到5.2. 4 d）的斜面培养基上，35±1°C条件下培养16-24小时从这一培养物上，再取一环细菌到新的斜面培 养基上，35±1C条件下培养16-20小时。

b） 样片准备从制品上切取边长为50±2mm，厚度不大于10mm［3］的方块，作为标准样片 空白对照样［4］6块［5］、抗菌样片3块如不能得到空白对照样，则利用5.2.2的薄膜密 切注意样片和样片制备过程中的微生物污染以及制品的污物污染最好从制品上采集样 片，如由于制品的形状的原因不能从制品采集样片，则利用相同的原料和工艺单独制备 样片备注：［3］ 如难以或不能将制品切成50±2mm，厚度不大于10mm的方块，也可采用非标准形 状和尺寸的样片，这一样片应该可以在其上覆盖400-1600mm2的薄膜［4］ 从空白样或薄膜制得的样片［5］ 6个未抗菌处理样片中，3个用于接种后零时间记数，另外3个用于接种后培养24 小时后记数c） 样片清洗用纱布或脱脂棉蘸酒精轻轻擦拭b）中样片2-3次，并干燥彻底若上述处理会 导致样片软化、样片表面涂层溶解及组分溶出等现象，则认为此种处理将影响试验结果， 可采用其他方法处理或直接试验而不进行任何处理d） 接种菌液的制备 将5.2.4 a）的营养肉汤稀释500倍，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节 pH至6.8-7.2,然后高压灭菌，作为1/500NB将a）中的前培养物取1环均匀分散到少量 的1/500NB中，采用显微镜观察法或其它合适的方法估计细菌数目，并用1/500NB稀释 菌液至细菌浓度为（2.5〜10）x105cfu/ml,以此作为试验用菌液。

若菌液不立即使用，将其 冷冻至0C，保存时间不超过4小时e） 试验菌液的接种将C）中的样片放入灭菌培养皿中，保持试。