檀香砧烯合成酶基因的克隆与序列分析.doc

檀香砧烯合成酶基因的克隆与序列分析作者：文海涛，赵红英，林励，邱贤秀【摘要】 目的通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的帖烯合成酶 基因方法利用CTAB LiCl法提取檀香已结香心材总RNA,采用RT PCR 技术克隆菇烯合成酶基因结果 克隆获得了一个檀香菇烯合成酶基因， 该基因编码区全长1 731 bp,编码576个氨基酸残基结论CTAB LiCl 法能提取较高质量的檀香心材总RNA,克隆获得的砧烯合成酶具有编码区关键词】 檀香；砧烯合成酶;基因克隆;序列分析Abstract:Objective To clone the terpene synthase gene from Sant alum album L. which par ticipates i n the synthesi s of essential o订.Methods CTAB LiCl treatment was used to extract total RNA from the heartwood of Santalum album L. And RT PCR was employed to clone the terpene synthase gene at the same time .Results One terpene synthase gene consisted of 1 731 bp nucleic acid was cloned from Sant alum album L. , which encodes 576 ami no acid residues. Conclusion CTAB LiCl treatment could extract high quality RNA from the heartwood of Santalum album L. , and the cloned terpene synthase genehad the open reading frame.Key words:Santalum album L. ; terpene synthase; gene cloning;sequence analysis名贵中药檀香为檀香科植物檀香(Santalum album L.)的树干心材, 为行气温中、开胃止痛之常用中药［1］。

檀香原产于印度、印度尼西亚等 地，1962年华南植物园从卬尼引种檀香并在广东地区试种成功［2］檀香 在自然生长情况下需10年左右才能初步形成具有芳香气味的心材(俗称结 香)，30年以上才能供药用，檀香心材挥发油是其主要活性成分，已有研 究表明檀香挥发油主要成分为祜烯类化合物，其中檀香醇等倍半祜烯类占 挥发油总量的60%〜80%［3］ o目前国内外对檀香研究的报道主要集中十檀香栽培技术和檀香挥 发油组分分析上［4］,而对檀香心材挥发油积累机理却鲜见报道鉴于此, 本研究拟对参与檀香祜烯类化合物生物合成过程中的关键酶一一帖烯合 成酶基因进行克隆和分析菇类物质的前体异戊烯基焦磷酸在菇烯合成酶 的作用下形成不同的菇类骨架，经过不同修饰酶的作用后形成不同的菇类 化合物，该酶基因的克隆将为阐明檀香挥发油积累的机理提供理论支持， 同时也为利用基因工程手段培育檀香良种、缩短檀香生长年限以及提高檀 香挥发油含量等方曲研究奠定坚实的基础1材料与方法1.1材料和试剂1.1.1材料 供试材料为广东湛江南药试验场的己结香檀香 (Santalum album L)心材，檀香树由广东省中药研究所邱金裕研究员鉴 定为檀香科植物檀香Santalum album L.。

采用钻孔取样的丿丁式收集已结 香部分心材，装入试管后迅速放入液氮罐速冻，取回后保存于-80 °C冰箱1. 1.2试剂RNA提取试剂包括溶液I与溶液II,溶液I : 2%CTAB, 2%PVP K30, 2 mol • L-lNaCl , 100 mmol • L-lTris HC1 (pH8.0) , 25 mmol • L-l EDTA(pII8. 0), 0. 5 g • L-l 亚精胺溶液 II : 0. 5%SDS, 1 mol • L-l NaCl, 10 mmol • L-lTris HC1 (pH8. 0), 1 mmol • LTEDTA(pH8・ 0), 2 种试剂均 用DEPC水配制反转录试剂盒:釆用Takara公司的PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kite克隆试剂盒:采用北京天根生化科技有限 公司的 pGM T 试剂盒Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker> T4 DNA Ligase、 限制性内切酶等均为Takara产品；引物合成和测序由英潍捷基(上海)贸易 有限公司完成其他试剂为国产分析纯1.2方法1.2. 1檀香心材RNA提取参照Chang等［5］方法进行提取并稍加改良。

改良之处为用三氯甲 烷/异戊醇(24 : 1)抽提两次、用10 mol • L-l L1C1沉淀过夜，其他不变1. 2. 2反转录采用 Takara 公司 PriineScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录RNA成cDNAo步骤为：(1)在离心管中依次加入总RNA 4 u L, oligo(DT) 1 p L, d\TP(10 mmol • L~l) 1 P L,加 RNase free water 至 总体积10 uL; (2) 65 °C保持5 min,迅速取出冰上放置3 min;⑶按顺 序分别加入 5 X Buffer 4 P L, RNase inhibitor 0. 5 u L, RNase free water 4. 5 u L, Prime Script RTase 1 u L, 42 °C保温 1 h, 70 °C灭活 15 mino 于-20°C保存备用1.2.3 PCR 扩增根据已登录NCBI的同源序列设计引物：F： 5’ TAT GGA TGC CTT TGC CAC TTC TCC GAC CTC 3’ ;R： 5’ TTC AAT CCT CCT CGT TCA GTG GAA TAG GGT 3’。

PCR 扩增体系：包括 Premix LA Taq 25 P L,引物 F 和 R 各 2 uL(10 P mol • L-l),模板 cDNA 2 u L,补充 ddlI20 至总体积50 » LoPCR 扩增条件：94 °C, 4 min;94 °C, 50 s, 59 °C, 50 s, 72 °C,2 min;34 循环;72 °C, 10 min01.2.4基因克隆与序列分析扩增产物电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收冃的条带，回收 产物定量后与克隆载体pGM T连接，转化大肠肝菌DII5 a ,蓝白斑筛选后 挑取白色单克隆进行扩大培养，选取经酶切和卩CR鉴定含有目的片段的克 隆送英潍捷基公司测序，测序结果通过NCBI中BLASTn和DNAstar以及 DNAssisl软件进行序列拼接和比对分析2结果与分析2. 1檀香心材总RNA提取采用CTAB提取、LiCl沉淀法提取的檀香心材总RNA,经1. 0%甲醛 变性凝胶电泳后,结果如图1所示从图1可以看出,提取的檀香心材总 RNA英28S和18S条带较清晰，稍有降解用核酸蛋白仪测定RNA的质量, 结果其A260/A280值均在1. 6〜2. 0之间,A260/A230的值在2. 0〜2. 3之间，说明此方法提取的RNA质量较好，可以用于后续实验。

取上述RNA中的3号样品进行RT PCR,产物经1. 0%琼脂糖凝胶 电泳检测，结果如图2所示在约1.8 kb大小的位置有一条带，与预期 片段大小一致凝胶回收该目的片段，连接pGM T载体，转化大肠杆菌 DII5ci,并进行蓝白斑筛选Figure 2 RT PCR of terpene synthase gene 蓝白斑筛选后，随机挑取儿个白斑摇菌，抽提质粒，质粒经RNase A消化示分别用EcoR I进行酶切和PCR扩增鉴定，结果如图3所示从图3可知，每个单菌落经酶 切后都得到大小约1.8 kb的条带，PCR扩增同样能扩增出片段，初步确定挑取的单菌落为阳性克隆子，含有冃的片段2. 3檀香砧烯合成酶基因序列分析将经初步鉴定的阳性克隆送英潍捷基公司测序，通过序列拼接后得 到全长为1 812 bp的序列，含有1 731 bp编码区，编码576个氨基酸残 慕，重命名为TPSlo利用NCBI中的BLASTn进行序列比对，发现该序列与 己在GenBank登录的一个同样来自于檀香(白檀)的单砧合成酶基因序列 (EU798692)同源性为99%,在全部1 731个碱基中只有6个存在差异两 个序列编码的氨基酸序列比对后发现，其同源性同样为99%,氨基酸残基 在4个位点上存在不同，分别是53位S/T、529位H/Y、439位T/I和515位D/G,此外两个氨基酸序列都具有植物砧烯合成酶家族的保守区域。

因 此初步推断本研究获得的基因为檀香菇烯合成酚基因3讨论檀香药用部位主要为结香的心材，檀香心材的形成过程也就是檀香 挥发油积累的过程，因此参与檀香挥发油形成的菇烯合成酶基因只在结香 的心材中特异地表达，另外由于植物木质部细胞本身的原因，所以给本研 究R7A的提取造成了一定困难木研究在尝试不同方法提取檀香心材总RNA 的时候效果都不理想，造成RNA提取困难的原因可能是檀香心材本身次生 代谢产物多，核酸难以溶出或与其他产物结合被除掉此外，心材部分不 是分生组织活跃的区域，活细胞少可能是造成提取后产量不高的原因经 过多次试验，本研究最后选用Chang等［5］的方法，并在此基础上稍加改 良，采用两次抽提去除杂质，加长沉淀时间至过夜的方法获得了较高质量 的RNA,可以用于后续RT PCR进行基因克隆分析其原因可能是重复抽 提去除了更多的影响RNA的蛋白质和多糖等杂质，另外在沉淀初期随着时 间的延长RNA的量会增加，但并不是时间越长越好本研究获得了一个檀香合成酶基因，进一步的功能验证正在进行 这为阐明檀香中祜烯化合物牛物合成奠定了基础，将为最终利用基因工程手段培育檀香良种和提高檀香品质提供科学依据。

参考文献】[1] 中华人民共和国药典委员会•中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010, 357-358.[2] 许明英，李跃林，任海，等.檀香在华南植物园的引种栽培[J]・ 经济林研究,2006, 24 (3) : 39-41・[3] 陈志霞，林励.不同提取方法对檀香挥发油含量及成分的影响 [J]・广州中医药大学学报,2001, 18(2) : 174-176.[4] 颜仁梁，林励.檀香的研究进展[J]・中药新药与临床药理， 2003, 14(3):218-221.[5] CHANG Shu jun, PURYEAR J, CATRNEY J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees[J]・Plant Mol BioRep, 1993, 11(2) : 113-116.。