4人工染色体载体说课材料.ppt

Date1利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源DNADNA片段复片段复制的载体称为制的载体称为人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体: :模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的段的DNADNA片段Date2vv目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（BACBAC）酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YACYAC）黏粒载体（黏粒载体（ cosmid cosmid ）P1P1人工染色体载体（人工染色体载体（PACPAC）Date3第一节第一节 黏粒黏粒（cosmidcosmid）载体载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体（柯斯质粒载体柯斯质粒载体）实）实际上是质粒的衍生际上是质粒的衍生物，是由英文物，是由英文“ cos “ cos site-carrying site-carrying plasmid”plasmid”缩写而成缩写而成的，其原意是指的，其原意是指带带coscos位点的质粒位点的质粒pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIDate5单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*6考斯质粒考斯质粒（cosmidcosmid）= = 质粒质粒+ cos+ cos序列。

序列pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIuu它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同 噬菌体的噬菌体的coscos位点构成位点构成uu coscos序列是序列是l l噬菌体噬菌体DNA DNA 中将中将DNADNA包装到噬包装到噬菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的DNADNA序列单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*7黏粒黏粒它的大小一般它的大小一般 5-7kb 5-7kb 左左右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段 DNA DNA克隆的最大克隆的最大 DNA DNA 片段可达片段可达45kb45kb质粒复制起点（质粒复制起点（colE1colE1） 象象质粒一样转化和增殖质粒一样转化和增殖抗性标记抗性标记AmpAmpr r cos cos位点有的粘粒载体含位点有的粘粒载体含有有2 2个个coscos位点pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalI一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途vv能像能像l l- -DNADNA那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；体细胞； vv能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；vv重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；vv装载量大装载量大（45 kb45 kb）且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小范围；范围；vv不能体内包装，不裂解受体细胞。

不能体内包装，不裂解受体细胞Date8二、二、 构建构建cosmidcosmid克隆载体的策略克隆载体的策略根据根据 噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由质粒质粒和含有和含有coscos位点位点的这种的这种DNADNA片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即cosmidcosmid克隆载体克隆载体Date9由由DNADNA片段和片段和pBR322pBR322质粒质粒DNADNA联合组成的联合组成的cosmidcosmid载体载体 - - pHC79pHC79Date10pBR322pBR322质粒质粒(p43)(p43)Date11用用 噬菌体基因组的噬菌体基因组的crorcror的的BglBgl限制片限制片段，取代段，取代pBR322pBR322质粒质粒DNADNA的位于的位于1 4591 4591 1 666bp666bp之间的之间的Sau3ASau3A片段，产生出具有片段，产生出具有BglBgl单单切割位点切割位点的重组体分子的重组体分子然后通过然后通过这个位点这个位点，将带有，将带有coscos序列序列、长度、长度为为1.78kb1.78kb的的DNADNA之之BglBgl片段片段插入进去，于是得插入进去，于是得到了到了pHC79pHC79柯斯质粒柯斯质粒. .Date12DNADNA片段除了片段除了coscos位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关的的DNADNA短序列；短序列；质粒质粒DNADNA部部分则是一个完整的分则是一个完整的复制子。

复制子克隆能力为克隆能力为313145kb45kb，而且能够被包，而且能够被包装成为具有感染性能装成为具有感染性能的噬菌体颗粒的噬菌体颗粒Date13三、三、 cosmid cosmid克隆载体的特征克隆载体的特征构建的构建的cosmidcosmid克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链DNADNA分子，分子，般在般在5-7kb5-7kb cosmidcosmid克隆载体具有质粒的性质克隆载体具有质粒的性质包括以下包括以下4 4个方面个方面Date14cosmidcosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增同样也会获得扩增cosmidcosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，作为重组体分子表型选择标记其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点上基因插入失活的克隆位点Date15具有具有 噬菌体的特性。

在此克隆载体上含有一噬菌体的特性在此克隆载体上含有一个个coscos位点 cosmidcosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源DNADNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对高效地转导对 噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞Date16进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的cosmidcosmid克隆载体克隆载体DNADNA分子，便按照分子，便按照 噬菌体噬菌体DNADNA同样的方式环化起同样的方式环化起来但由于但由于cosmidcosmid克隆载体并不含有克隆载体并不含有 噬菌体的全噬菌体的全部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒法形成子代噬菌体颗粒外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑落的形式表现出来的，而不是噬菌斑Date17构建的构建的cosmidcosmid克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较大的外源大的外源DNADNA片段 如果如果cosmidcosmid克隆载体的大小为克隆载体的大小为6.5 kb6.5 kb，按入噬，按入噬菌体容许菌体容许包装包装的的量量计算，能承载的外源计算，能承载的外源DNADNA片段片段最大可达最大可达44.5 kb(44.5 kb(即即51 kb51 kb6.5 kb)6.5 kb)，最小的也有，最小的也有29.9kb(29.9kb(即即36.4kb36.4kb6.5kb6.5kb) )，所以用这样的，所以用这样的cosmidcosmid克隆载体能克隆克隆载体能克隆40kb40kb左右的外源左右的外源DNADNA片段。

片段 Date18四、四、cosmidcosmid克隆载体的工作原理克隆载体的工作原理cosmidcosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制 实际上，使用实际上，使用cosmidcosmid克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它的的 噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质 Date19因为因为cosmidcosmid克隆载体含有克隆载体含有coscos位点，可位点，可承载大的承载大的DNADNA片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高效率转导受体细胞效率转导受体细胞 使用使用cosmidcosmid克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用 噬菌噬菌体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同 Date20作为作为 噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组DNADNA分分子两端必须各有一个子两端必须各有一个coscos末端而cosmidcosmid克隆载克隆载体只有一个体只有一个coscos位点，因此必须先对位点，因此必须先对cosmidcosmid克隆克隆载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个coscos位点的二位点的二联体线形联体线形DNADNA分子。

分子Date21当外源当外源DNADNA片段组入二联体线形片段组入二联体线形DNADNA分子分子，并且两个，并且两个coscos位点之间的位点之间的DNADNA核苷酸序列达到核苷酸序列达到足够长时，两个足够长时，两个coscos位点可被位点可被A A蛋白切割，产生蛋白切割，产生具有两个具有两个coscos末端的重组末端的重组DNADNA分子，就能进行分子，就能进行有效的体外包装有效的体外包装 Date22使用使用cosmidcosmid克隆载体的基本程序是：克隆载体的基本程序是： 先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割cosmidcosmid克隆载体克隆载体 具有两个具有两个coscos位点的二联体线形位点的二联体线形DNADNA分子分子 DNADNA连接酶连接酶 切割二联体线形切割二联体线形DNADNA分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源DNADNA片段片段 成为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品 DNADNA连接酶连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Date23Date24Date25不管是不管是(a)(a)程序还是程序还是(b)(b)程序，最后获得的重程序，最后获得的重组线形组线形DNADNA分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点(ori)(ori)和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形DNADNA分分子导入受体细胞后，子导入受体细胞后，coscos末端自行连接环化，按末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。

择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子Date26五、五、 cosmid cosmid克隆载体（自学克隆载体（自学P P7272）vv常用的粘性粒有常用的粘性粒有PHC79PHC79、PJB8PJB8、MUA-3MUA-3和和KOSIKOSI等，它们大多具等，它们大多具有一种或多种限制性有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点内切酶的单一酶切位点采用这种大容量采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组DNADNA文库的重文库的重组克隆数目，减少工作量，提。