限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用.ppt

PPT限制性核酸内切酶切割原理、方法、结果分析及应用课堂内容回顾：1 1、定、定义：： 1 1、定、定义：：限制性核酸内切限制性核酸内切酶是可以是可以识别特特定的定的核苷酸序列，并在每条核苷酸序列，并在每条链中特定部位的中特定部位的两个核苷酸之两个核苷酸之间的的磷酸二磷酸二酯键进行切割的行切割的一一类酶，，简称限制称限制酶2 2、分、分类：：（根据（根据（根据（根据酶酶的基因、蛋的基因、蛋的基因、蛋的基因、蛋白白白白质结质结果、依果、依果、依果、依赖赖的的的的辅辅助因子及助因子及助因子及助因子及DNADNADNADNA裂解的特裂解的特裂解的特裂解的特异性，将限制性内切异性，将限制性内切异性，将限制性内切异性，将限制性内切酶酶分分分分为为三种三种三种三种类类型）型）型）型）ⅠⅠ型型酶：具有：具有DNADNA修修饰的作用在非特异位点的作用在非特异位点处切割切割DNADNAⅡⅡ型型酶：是最重要的工具：是最重要的工具酶‘ ‘能在能在DNADNA分子内部的特异分子内部的特异位点位点识别和切割和切割DNADNA双双链，所，所 以通常所以通常所说的限制性的限制性内切内切酶就指就指这一一类酶。

ⅢⅢ型型酶：与：与ⅠⅠ型型酶一一样，具有限制与修，具有限制与修饰活性，其切活性，其切割位点很割位点很难预测{Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNAⅡⅡ型型酶酶：：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所 以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测3 3、命名：、命名：规则规则：：第一个字母（大写）：取自第一个字母（大写）：取自该该酶酶的的细细胞属名胞属名第二、三个字母（小写）：第二、三个字母（小写）：该细该细胞的种名胞的种名第四个字母（第四个字母（罗马罗马数字）：代表同一菌株中数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切不同限制性内切酶酶的的编编号号例如：例如：EcoRⅠⅠ、、HindⅢⅢ 等等等等限制性核酸内切酶切割原理1、、ⅠⅠ类类和和ⅢⅢ类类酶酶：： 在同一蛋白在同一蛋白质质分子中兼有切割和修分子中兼有切割和修饰饰（甲基化）作用且依（甲基化）作用且依赖赖于于ATP的存在ⅠⅠ类类酶酶结结合于合于识别识别位点并随机的切割位点并随机的切割识别识别位点不位点不远处远处的的DNA，而，而ⅢⅢ类类酶酶在在识别识别位点上切割位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。

分子，然后从底物上解离2、、ⅡⅡ类类由两种由两种酶酶组组成：成： 一种一种为为限制性内切核酸限制性内切核酸酶酶（限制（限制酶酶），它切割），它切割某一特异的核苷酸序列；某一特异的核苷酸序列； 另一种另一种为为独立的甲基化独立的甲基化酶酶，它修，它修饰饰同一同一识别识别序列ⅡⅡ类类中的限制性内切中的限制性内切酶酶在分子克隆中得到了广泛在分子克隆中得到了广泛应应用，它用，它们们是重是重组组DNA的基的基础础绝绝大多数大多数ⅡⅡ类类限制限制酶酶识别长识别长度度为为4至至6个核苷酸的回文个核苷酸的回文对对称特异核苷酸序列，称特异核苷酸序列，产产生生5'或或3'黏性末端（也有一些黏性末端（也有一些产产生平端或生平端或钝钝端）端） 几种限制性内切酶的切割位点几种限制性内切酶的切割位点例如：3、同工异源、同工异源酶酶：来源不同但能：来源不同但能识别识别和切割同一位和切割同一位点的点的酶酶如：BamHⅠⅠ和和BstⅠⅠ，，XhoⅠⅠ和和Pae R7等可以相互代替使用等可以相互代替使用4、同尾、同尾酶酶：：识别识别序列不同，但序列不同，但产产生相同末端的限生相同末端的限制性内切制性内切酶酶。

如：如：BamHⅠⅠ和和Sau3AⅠⅠ等由此等由此产产生生的的DNA片段可借黏性末端相互片段可借黏性末端相互连连接，操作是具有更接，操作是具有更大的灵活性大的灵活性•通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法o方法：1.质质粒的构建粒的构建 采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA 片段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒2.酶酶切、构建、片段的切、构建、片段的纯纯化和化和连连接接 按Maniatis等方法进行3.重重组质组质粒的粒的转转化化 转化采用“热休克”法4.重重组质组质粒的提取粒的提取 挑取阳性克隆，在LB培养基中培养，采用碱裂解法提取重组质粒5.定量定量 取5μLDNA溶液用4.5μl去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读取AZ60和AZ80吸光度值，计算出AZ60/AZ80比值，按下列公式计算质粒DNA浓度,本实验中质粒DNA浓度为1.0g/L质粒 DNA 浓度(g/L)=AZ60X稀释度/Z0=AZ60X56.重重组质粒粒的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切 取0.5ml离心管15只，分别加入质粒 2μl(2μg)，依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水 13.5μL、 混匀、点动离心，37 ℃ 水浴孵育2小时。

7、配置配置1.51.5％的％的琼脂糖凝胶脂糖凝胶 称取琼脂糖0.6g, 加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火120s，熔化后冷却至60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入电泳槽中电泳槽中加入1×TAE缓冲液8、电泳泳 取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察到橘红色DNA条带，结果如图Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.•结果•重重组组质质粒粒pBKrsv-MLCK pBKrsv-MLCK 全全长长7378bp7378bp，，通通过过 DNAstarDNAstar软软件件分分析析获获得得各各酶酶酶酶切切位位点点的的信信息息，，选选择择在在插插入入片片段段中中单单独独存存在在和和在在插插入入片片段段与与质质粒粒序序列列中中均均含含有有的的限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切位位点点，，计计算算酶酶切切后后片片段段大大小小的的理理论论值值经经各各种种限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切后后，，获获得得不不同同大大小小的的片片段段，，经经电电泳泳分分析析与与理理论论设设计计完完全一致。

全一致•结果分析•限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在选择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要•在进行限制性内切酶实验时首先应进行 DNA的定量，1U 酶的限制性内切酶活性指在一定时间内(60min)~适当温度下和建议使用的缓冲液中,在50μl反应体系中,将1μg底物 DNA 完全消化所需要的酶量l单位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物时,应根据情况确定所用酶量l根据本实验室的经验,1μg底物 DNA 加入 5 U 的限制性内切酶在2h时间内可以酶切完全，通常延长消化实验中可能出现的问题及其讨论•解决方法解决方法•1.标准底物检测酶活性•2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA•3.检查反应系统是否最佳•4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株•5.换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增•6.将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证•7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证一一.如如果果DNA完完全全没没有有被被内内切切酶酶切割？切割？1.内切酶失活2.DNA不纯，含有SDS，酚，EDAT等内切酶抑制因子3.条件不适（试剂、温度）4.DNA酶切位点上的碱基被甲基化5.DNA酶切位点没有甲基化(如Dpn1)6.DNA位点上存在其它修饰7.DNA不存在该酶识别顺序•解决方法解决方法二二.如果如果DNA切割不完全？切割不完全？1.内切酶活性下降2.内切酶稀释方法不正确3.DNA不纯，反应条件不佳4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰5.部分DNA溶液粘在管壁上6.内切酶溶液粘度大，取样不准7.酶切后DNA粘性末端退火8.由于反应溶液、温度使内切酶变性9.过度稀释使酶活性降低10.反应条件不适11.识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序1.用5-10倍量过量消化2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.同上4.同上5.反应前离心数秒6.将内切酶稀释，增大取样体积7.电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8.使用标准反应缓冲液及温度9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10.使用最佳反应体系11.加大酶量5-10倍•1.用λDNA作底物检查酶切结果•2.电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段三三.如如果果DNA片片段段数数目目多于理多于理论值论值？？1.其它内切酶污染2.底物中含其它DNA杂质解决方法解决方法限制性核酸内切酶的应用l用于DNA基因组物理图谱的组建l基因的定位和基因分离lDNA分子碱基序列分析l比较相关的DNA分子和遗传工程u 将水稻叶绿体的将水稻叶绿体的DNADNA，用，用EcoR1EcoR1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶消化后，放消化后，放入含有溴化乙锭的低熔点（入含有溴化乙锭的低熔点（LMPLMP）的）的1%1%琼脂糖凝胶中做电泳分离。

琼脂糖凝胶中做电泳分离从从LMPLMP中分离出分子大小为中分离出分子大小为1.8-2.5kb1.8-2.5kb之间的之间的DNADNA片段，再与同样片段，再与同样经过经过EcoR1EcoR1限制性核制性内切酶限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了脱磷酸切割并用碱性磷酸酶做了脱磷酸化处理的化处理的pBR322pBR322质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌53465346菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成AmprAmpr转化子菌落群体转化子菌落群体这样就构成了由这样就构成了由EcoREcoR 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割的水稻切割的水稻DNADNA基因组基因组库用AmprAmpr转化子菌落与转化子菌落与32P32P放射性标记的放射性标记的psbA DNApsbA DNA探针做菌落探针做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体从这些阳性克隆体中分杂交，可以分离出其中的阳性克隆体从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒离出来的重组体质粒DNADNA，经进一步的分析，就能测出水稻叶绿，经进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因体基因psbApsbA的序列。

的序列应用一应用二u 利用利用pBR322pBR322作为载体作为载体重组人体的抑生长激素重组人体的抑生长激素也是一个也是一个经常提到的应用例子其过程和水稻叶绿体基因重组大经常提到的应用例子其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有还将含有laclac操纵子操纵子起始部分的片段（包括启动子，操起始部分的片段（包括启动子，操作区，核糖体集合位点和作区，核糖体集合位点和ββ- -半乳糖苷酶的主要部分）半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边由于有了插在抑生长激素基因的旁边由于有了laclac操作子操作子的控的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。