hplc测留兰香油中主要成分.doc

高效液相色谱法分析留兰香油中主要成分彭丽娟，张瑞伦（烟台大学化学与化工学院，山东 烟台 264000）摘要：考查留兰香油的理化性质，用高效液相色谱法（HPLC）测定其主要成分香芹酮和柠檬烯含量方法采用 ODS C18（ 250mm×4.6mm,5µm） 色 谱 柱 ； 以 甲 醇 :水 （ 75:25）为 流 动 相 梯 度 洗 脱 ； 流速 为 1ml·min-1； 柱 温 为 20℃ ； 检 测 波 长 为 200nm 结 果 香 芹 酮 和 柠 檬 烯 线 性 范 围 均 在0~1.4mg·ml-1 和 1.4~4.0mg·ml-1 内 ， 线 性 关 系 良 好 （ R2≥0.997） ， 精 密 度 、重复性和稳定性很好，为留兰香油质量综合评价提供了简单、准确、可行的分析方法 关键词：高校液相色谱; 留兰香油; 流动相Determination of basic compositions purityin spearmint oil with HPLCPENG Lijuan，ZHANG Ruilun(School of Chemistry and Chemical Engineering， Yantai University， Yantai 264000， Shangdong， China)Abstract：HPLC is an analysis method which has been widely used. Carvone and limonene are the two basic compositions in spearmint oil .Checking the properties of spearmint oil ,and establish the method to determine the basic compositions—carvone and limonene in it with HPLC ,and choose the best measuring wavelength and mobile phase. Adopt ODS C18（ 250mm×4.6mm,5µm） chromatographic column with column temperature 20℃ ,when the wavelength is 200nm and mobile phase is methanol to H2O with a ratio 75:25, peak area of carvone and limonene has good linearity with their concentration（ R2≥0.997） . Both of them are between zero to 1.4mg·ml-1 and 1.4~4.0mg·ml-1.The method is simple and easy, has great sensitive、precision and stabilization. It can be a way to determine the basic compositions—carvone and limonene in spearmint oil and evaluate the quality of it.Key words: HPLC; spearmint oil; mobile phase 引 言留 兰 香 油 作 为 一 种 植 物 香 料 ， 在 “崇 尚 自 然 、 回 归 自 然 ”为 口 号 的 今 天 ， 日 益 显现 出 巨 大 的 魅 力 。

它 无 论 是 在 日 用 品 工 业 还 是 食 品 工 业 ， 甚 至 医 药 工 业 均 有 大 量 应 用 ，通 常 用 香 芹 酮 含 量 作 为 其 主 要 的 质 量 指 标 [1]在 现 代 分 析 方 法 中 ， 气 相 色 谱 （ GC)、 高 效 液 相 色 谱 （ HPLC)、 质 谱 （ MS)、 核磁 共 振 谱 （ NMR)、 红 外 光 谱 （ IR)、 紫 外 分 光 光 谱 法 （ UV)都 比 较 简 便 安 全 ， 其 中 气相 色 谱 和 液 相 色 谱 应 用 最 为 广 泛 [2-7] 气 相 色 谱 只 能 分 析 挥 发 性 物 质 ， 不 能 用 于 热 不稳 定 性 物 质 的 分 析 ， 高 效 液 相 色 谱 可 以 解 决 这 两 个 难 题 高 效 液 相 色 谱 只 要 求 试 样 能制 成 溶 液 ， 而 不 需 要 气 化 ， 因 此 不 受 试 样 挥 发 性 的 限 制 [10,11] 它 的 分 离 效 能 高 、检 测 灵 敏 度 高 、 分 析 速 度 快 ， 广 泛 应 用 于 分 离 、 分 析 高 沸 点 、 热 稳 定 性 差 、 有 生 理 活性 及 相 对 分 子 量 比 较 大 的 物 质 。

由 于 留 兰 香 油 沸 点 达 到 230℃ 且 为 热 不 稳 定 性 物 质 ，用 高 效 液 相 色 谱 作 为 分 析 方 法 是 非 常 合 适 的 本 实 验 即 是 研 究 了 在 既 有 HPLC 条 件下 如 何 准 确 有 效 的 分 析 留 兰 香 油 中 的 主 要 成 分 -香 芹 酮 和 柠 檬 烯 ， 并 给 出 了 一 定 浓 度范 围 内 的 标 准 曲 线 ， 可 用 来 测 定 浓 度 和 评 定 质 量 [9-11]1 实验材料和方法1.1 材料留 兰 香 油 、 甲 醇 、 乙 腈 、 乙 醇 和 四 氢 呋 喃 ， 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 提 供 ，除 留 兰 香 油 纯 度 未 知 外 其 余 均 为 色 谱 纯 标 准 品 柠 檬 烯 和 香 芹 酮 ， 购 于 上 海 安 普 科 学 仪器 有 限 公 司 实 验 用 水 为 杭 州 娃 哈 哈 集 团 有 限 公 司 生 产 的 纯 净 水 1.2 装置和仪器Waters1525 高效液相色谱仪，美国 Waters 公司电子精密天平，AR2130 ，奥豪斯（上海）公司。

普通分析天平KQ-100E 型超声波清洗器UV-2501 PC 紫外可见光分光光度计，日本岛津公司WZZ-I 自动指示旋光仪，上海光学仪器修理厂1.3 色谱条件的确定实验固定条件:高效液相色谱仪 Waters-1525，紫外检测器(Dual λ Absorbance Detector),色谱柱 ODS C18（ 250mm×4.6mm,5µm）,流动相流速 1ml/min,柱温 20℃1）检测波长的确定 [12]：分别制备一定质量浓度的香芹酮-甲醇溶液、柠檬烯-甲醇溶液，经紫外分光光度法进行 190～400nm 全波长扫描2) 流动相的选择：在固定条件和检测波长 200nm 下，换取下列不同的流动相（均为体积比）对留兰香油进行液相色谱分析①甲醇:水（70:30，75:25，80:20）②乙腈:水（40:60 ，60:40，70:30，80:20）③甲醇: 乙腈:水（40:40:20，45:45:30，50:50:20）④四氢呋喃:水（70:30，75:25） 1.4 标准曲线的绘制实验取 0.1ml 样品，用甲醇定容稀释至 25ml 容量瓶分别精密称取不同质量的香芹酮、柠檬烯标准品，均由甲醇定容，制备一系列浓度的香芹酮- 甲醇、柠檬烯- 甲醇标准品溶液。

在如下色谱条件下：色谱柱 ODS C18（250mm×4.6mm,5µm ） ，检测波长 200nm,柱温20℃，流动相甲醇:水(75:25),流速 1ml/min，取配制好的标准品溶液，分别进样 20μL，取3 次的平均值，以香芹酮（柠檬烯）的质量浓度为纵坐标，其对应的峰面积为横坐标，线性回归得回归方程 [10-13]1.5 精密度实验在 1.4 所述色谱条件下，对 0.392mg/ml 香芹酮标准品和 0.9472mg/ml 柠檬烯标准品进行色谱分析分别每隔两小时连续进样 5 次，计算日内标准偏差；每天进样一次，连续五次，计算日间标准偏差1.6 重复性实验在 1.4 所述色谱条件下，对同一批样品进行色谱分析，连续进样，测定 10 次，记录峰面积，计算 RSD 值1.7 稳定性实验在 1.4 所述色谱条件下对 0.098mg/ml 香芹酮标准品溶液和 0.646mg/ml 柠檬烯标准品溶液进行色谱分析分别在 5h 之内，间隔 1h 进样一次，记录峰面积，计算 RSD 值2 实验结果与讨论2.1 色谱条件的确定2.1.1 检测波长图 1 香芹酮标准品-紫外可见扫描Fig.1 Uv-vis scanning of carvol reference substance图 2 柠檬烯标准品-紫外可见扫描Fig.2 Uv-vis scanning of limonene reference substance由扫描曲线图可以看出，香芹酮在 235nm 处有最大吸收，柠檬烯在 200nm 左右有最大吸收，实验过程中为了同时检测出这两种物质，选择检测波长为 200nm。

2.1.2 流动相 AU0.1.2.03. Minutes2.406.801.24.0168.02.4026.803.24.0368.042.40图 3 流动相为甲醇:水（70:25）时的色谱图Fig.3 Chromatogram of mobile phase methanol to H2O with a ratio 75:25经实验在一个小时内，当流动相为甲醇:水时，70:30 只能检测到香芹酮， 80:20 以及75:25 可以将两种物质同时检测出虽然 80:20 出峰时间比较短，在 20 分钟内便可，但是对香芹酮附近的物质分离效果不是很好75:25 基线分离，峰形尖锐当流动相为乙腈: 水时，40:60 只能检测到香芹酮，其余四种可以将两种物质同时检测出但是 80:20 在香芹酮附近连峰，基线未完全分离开相对于 70:30，60:40 出峰时间较长 70:30 可以在短时间内有效检测出香芹酮和柠檬烯，且效果良好当流动相为甲醇:乙腈: 水时，45:45:30 只能检测到香芹酮，其余两种虽可将两种物质同时检测出，但基线未完全分离开，均出现连峰情况，不适合来分析留兰香油主要成分当流动相为四氢呋喃: 水时，70:30 和 75:25 都只能检测都香芹酮，不适合来分析留兰香油主要成分。

综合各流动相，甲醇:水（75:25 ）和乙腈:水（70:30）检测效果是最好的考虑到两者的经济成本等因素 [14]，最终选择甲醇:水（75:25）作为流动相2.2 标准曲线的绘制 以香芹酮（柠檬烯）的质量浓度为纵坐标，其对应的峰面积为横坐标，作标准曲线图 4 柠檬烯标准曲线Fig.4.Standard curve of limonene图 5 香芹酮标准曲线Fig.5.Standard curve of carvol在选定的实验条件下，香芹酮在低浓度 0～1.4mg/ml 范围内，回归方程 Y=0.056X-0.055,R2=0.997；在高浓度 1.4～4mg/ml 范围内，回归方程 Y=0.266X-5.655，R 2=0.997柠檬烯在低浓度 0～1.4mg/ml 范围内，回归方程 Y=0.019X-0.021,R2=0.999；在高浓度1.4～4mg/ml 范围内，回归方程 Y=0.057X-2.827，R 2=0.995实验定量准确，在一定浓度范围内，香芹酮和柠檬烯的 TUV 响应与其浓度线性相关，相关系数高，线性关系良好，可以作为留兰香油中主成分的测定依据 [15]2.3 精密度香芹酮连续进样五次 RSD=0.22%,日内 RSD=0.36%日。