膜蛋白的提取与分离.doc

膜蛋白的提取与分膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"1925年 Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出：" 细胞膜是由双层脂分子组成 "1935年 Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的 "三明治结构模型 "， 即蛋白质－脂 - 蛋白质1959年 Robertson: 用电镜观察生物膜提出 "单位膜模型 " ，将膜的分子结构与超微 机构统一起来厚度：2( 暗)+3.5( 亮)+2(暗) =7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境 ;(2) 选择性的物质运输， 包括代谢底物的输入与代谢产物的排除， 其中伴随着能量 的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接 ;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但 却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在 膜蛋白、内在膜蛋白1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或 脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来， 膜结构并不被破坏2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent)使膜解后才可分离出来获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的 整和膜蛋白，膜蛋白，至怕前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用2 — D技术也好，ICAT乃至 proein microarray 都还不能有效解决这一问题蛋白抽提三、谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电 点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这 些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化由于蛋白质种类繁多，不同 的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同 . 根据蛋白质的溶解特性， 同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取 .四、 但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜 中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去 污剂把蛋白从膜中释放出来。

膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐， CHAPSt种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂五、 1、分离膜蛋白的方法（原则性） ：六、 1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻 璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白 的粗组分例如： michael11 液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂 差速离心蔗糖密度梯度离心收集 37%与41%间的成分，即为质膜部分裂解即 可收集膜蛋白）七、 2）用特殊的去污剂选择性的分离从膜上提取蛋白有许多困难 . 在多数情况 下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来， 然后将蛋白质稳定 . 去垢 剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还 要考虑到以后的纯化步骤 . 虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化， 但最终仍可能需要除去去垢剂 . 这常常会引起蛋白质失活， 但如果蛋白质是用于测 序的，他将不是一个问题 . 如果不是用于测序的， 可考虑使用能够黏附去垢剂的疏 水珠. 许多文献和生化试剂供应商的产品目录中， 都介绍有许多种不同的可用来溶 解膜蛋白的去垢剂 . 然而，他们并不是普遍适用的 .在设计膜蛋白溶解方案时，必 须考虑某一去垢剂的特殊性质•如trit on X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质 的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.八、 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来 . 这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白， 而无需考虑胞质蛋白、 细胞核成分或染色质成分的混入 . 使用这种方法所获得的膜 蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ <5000Da要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1%，所以充分的膜蛋白的提取， 无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的 . 第二种方法简单， 可靠，但有 时含有其他蛋白。

一般的都是利用 4度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX114 水溶液，在温度超过 20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水 相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中利用此性质可提取膜蛋白九、 3 ）膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）CMP+ 分离强疏水 性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS溶解膜蛋白后形成SDS- 融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化羟基磷灰石柱具有阴离子 磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的 大小、SDS结合量有关利用原子散射法研究 CAMP的分离机制发现，样品与 SDS 结合后在离子交换柱上存在 SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交 换，从而达到分级分离的目的十、层析柱提取（参步骤）十二、 4） 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白 溶解液进行抽提的方法 用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白； 最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液， 最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

十三、 5）Centrifugal protein extraCtion.离心的CellsTns exlractionlOmin vortex, 40 mtervars sonifpcationoentnfuge伽g伦0眄259cytosol pelletIUrea/Thiourea extraction10min vort&x3 40 伯怕rv^ls sonrficationcentnfuge1Cmin, -l2n000g, 25*Cmembran 总 fraction pellet原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级（胞浆和胞膜）之间有清洗的步骤，但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分 之间仍然有不少重复的点.该方法相较 MOLLOY MP授在1998年electrophoresis 上发表的分级抽提法减去了第一步（用tris抽提水溶性蛋白）和最后一步（极难溶 蛋白）,在操作上也作了简化，总而言之是一种不错的方法codegreen）6）deterge nt- based :提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯 度离心分离细胞器（ER），然后分级抽提方法。

例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就 是核膜，再裂解得到核膜蛋白而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分总的感受：细胞的量要很充足之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免 疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚 试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈2、分离膜蛋白的方法(操作)1) 分离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 A 中，于室温与液氮罐中反复冻融 2次2 5000 转4度离心，驱除核及未裂解的细胞3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B中4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2) 分离细胞膜蛋白的方法：1、 细胞放在冰上，去除上清，用 pH7。

4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、 加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min3、 刮下单层细胞， 4度下10 000g 5min 离心 4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min5、收集水相留作分析 6用500ul冰冷的buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6 再次离心7、 按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积8、 用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1、 2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl （pH75）、蛋白酶抑制剂2、 缓冲液 A （含05mol/LNaCI 的 RIPA buffer）3、 buffer C10mmol/L Tris HCl（pH7.5）150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA（PH7.5）3）分离细胞膜蛋白的方法：7M urea2M thiourea4%chaps2.5%sb3-10 1000000个细胞，可用此 buffer 1ml 。

冰浴匀浆冰上置 30分钟4度高速低温离心 30min取上清 -20保存4）分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆2、 J6-HC离心机800rpm, 4C离心10min后，所得上清液转入超速离心管3、 lOOOOOg, 4C离心1hr弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr 后分装至EP管，Eppendorf台式离心机lOOOOrpm, 4C离心3Omin4、 收集所得上清液即为膜组份Buffer A: 0.32M 蔗糖，5mMTris-HCI （PH7.5 ），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA, O.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 冰上预冷Buffer B: 20mMHEPES PH7.5 ），10^甘油，2%Triton X-100, 1mMEDTA,1mMEDTA, O.2mM PMSF, 1ug/mI Leupeptin, 1ug/mI Pepstatin A, 1ug/mI Aprotinin 冰上预冷。

5）分离组织膜蛋白的方法:RIPA1XPBS1%NP4O0.5去氧胆酸钠0.1%SDS 以下用时加入10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度 10ul/ml ）Aprotinin。