HT29细胞.doc

苦参碱对人类结肠癌细胞苦参碱对人类结肠癌细胞 HT29 增殖的影响和它的抗肿瘤机制增殖的影响和它的抗肿瘤机制摘要摘要苦参碱是从苦参根中提取的主要活性成分，该化合物在多种癌细胞中具有很强的抗肿瘤活性然而，苦参碱的在结肠癌细胞中的抗肿瘤活性仍不明确，这项研究的目的是为了考察苦参碱对人类结肠癌细胞生长和相关蛋白表达的影响采用MTT法测定细胞增殖，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期分布和凋亡蛋白质印迹分析法检查胱门蛋白酶的活化以及抗凋亡和促凋亡因子的表达据证明，随着时间和剂量苦参碱能显著显著抑制HT29细胞的增殖，也能减少 G2/M时相细胞的百分率，这很可能与增加细胞周期中G0/G1细胞时相的阻滞有关蛋白质印迹分析法表明，苦参碱能诱导半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-9活化并促进细胞色素C从线粒体释放到胞浆此外，促凋亡因子Bax上调和抗凋亡因子Bcl‑2下调，最终将导致Bcl‑2/Bax蛋白的比率降低结果表明，在体内苦参碱能抑制细胞增殖并诱导 HT29人类细胞的凋亡通过上调 Bax下调 Bcl-2可诱导细胞凋亡，细胞色素C从线粒体释放到胞浆和胱门蛋白酶-3胱门蛋白酶-9的激活后，将会引起重要的凋亡级联反应。

苦参碱在HT29人类细胞中有很强的抗肿瘤活性，在治疗结肠癌中可以作为一种新的有效试剂材料与方法材料与方法试剂和药物试剂和药物苦参（化学结构如图 1，纯度>98%,用于高效液相分析） ，苦参碱性的分子式为 C15H24N2O，分子量 248.36这项研究中，苦参溶解在细胞培养基中，储备液浓度 20 mg/ml，并在-20℃储存每个实验开始前，储备溶液要现稀释于培养基中胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，杭州，中国） RPMI‑1640 培养基（基凯基生物科技有限公司，中国南京） ，十二烷基硫酸钠（SDS） ，MTT，L-谷氨酰胺和膜联蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V‑FITC/PI) 凋亡检测试剂盒（北京 Biosea 生物技术有限公司，北京，中国）特异性抗体 Bcl-2，Bax，细胞色素 C 和和 β-肌动蛋白（R＆D 系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国），抗 半胱天冬酶-3 和 半胱天冬酶-9（武汉博士德生物工程有限公司，武汉，中国） ，JC-1 探测器（Beyotime 生物技术研究所，南通，中国）细胞系和细胞培养细胞系和细胞培养人类结肠癌 HT29 细胞系（武汉大学中南医院，肿瘤部门，中国武汉）。

将该细胞培养在 RPMI-1640 培养基中，培养基中有 10％热灭活的胎牛血清（FCS） ，1％L-谷氨酰胺和 1％青霉素 - 链霉素，置于含有 5%二氧化碳的潮湿环境中用 25cm²的组织培养瓶单层培养 HT29 细胞，并定期用 1％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA）溶液将细胞与培养瓶表面分离用 CC‑108 微型血球计数器（希森美康，日本神户）确定细胞数量对数生长期的细胞用于以下阐述的所有研究MTT 实验实验MTT 实验检测线粒体脱氢酶还原形成的蓝色甲臜产物，它反映了细胞线粒体的正常功能和细胞的存活率当用苦参碱孵育在 96 孔板上的细胞 24, 36 或 48 h 后，用磷酸缓冲液洗涤细胞（104/孔）两次，然后将 MTT 溶液(100 μg/0.1 ml PBS 缓冲液 )加到每个空中细胞在 37℃的条件下孵育 4h加入 100μl 二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜结晶，用分光光度计在 570nm 处测量吸光度细胞增殖抑制率计算方法：1-（给药组孔中的平均 OD 值/对照组孔中的平均 OD 值）*100如之前所阐述的，HT29 细胞的增殖反应用 MTT 法测定，这次及所有后续实验都要重复 3 次。

细胞周期分析细胞周期分析为了分析细胞周期，收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度 1x106个/ml，用不同浓度的苦参碱(4, 8 或 16 mg/ml)处理细胞处理 24h 后，收集漂浮和附着细胞，离心，用冷的磷酸缓冲液洗涤，并固定在 70%的冷乙醇中于 4℃过夜加入含有 50 μg/m PI，3.4 mmol/l 枸橼酸钠， 20 μg/ml 的 RNA 酶 A 和 1%的 Triton X‑100 的荧光染料溶液，混合物在室温黑暗的条件下培养 30min.用流式细胞仪（德国明斯特）测量细胞周期分布，并用使用 Cell Quest 软件（Beckton Dickinson 公司，富兰克林湖，新泽西州，美国）进行流式细胞法分析通过通过 AnnexinAnnexin V V‑ ‑FITC/PIFITC/PI 双染色法用流式细胞仪评估细胞凋亡双染色法用流式细胞仪评估细胞凋亡用 Annexin‑V‑FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡将 HT29 细胞均匀的分布在培养瓶中，并用 0, 4, 8 和 16 mg/ml 浓度的苦参碱处理细胞 24h,收集细胞，用 PBS 缓冲液洗涤两次并重新悬浮在 1x106 个细胞/ml 的膜联蛋白-V 结合缓冲液中。

用 5 μl 膜联蛋白-V-FITC 和 5μlPI 在室温避光的条件下孵育上清液（100 微升/管）15min,然后向每管加入 400 μl 结合缓冲液，染色 1h 后用流式细胞仪分析，所有实验重复进行三次细胞色素细胞色素 C C 从线粒体向细胞质释放的检测从线粒体向细胞质释放的检测用蛋白质印迹分析法检测细胞色素 C 在细胞质和线粒体的分布，分别处理细胞并用冰冷的 PBS 缓冲液洗涤后，收集细胞为了分离线粒体和细胞质，将细胞在缓冲液中超声，缓冲液含有 10 摩尔 PH7.5的盐酸缓冲液，10mol 氯化钠，175mol 蔗糖和 12.5 摩尔 EDTA,以1,000 x g 离心细胞提取物 10min 成核，将得到的上清液在 18,000 x g 下离心 30min 沉淀线粒体并纯化得到的上清液为细胞质将沉淀溶解，用 Bradford 蛋白质测定法评价两个组分的蛋白含量，等量的蛋白被 15%钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‑PAGE）分离并电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后将该膜温育在含有 5%脱脂乳的洗膜缓冲液（TBST）中 2h，接着分别用一级抗体过夜培养，用 TBST 充分洗涤培养后的薄膜后，再用二级抗体培养薄膜 2h，随后用 TBST 充分洗涤后，用电化发光(ECL)检测试剂盒检测免疫复合物。

蛋白质印迹分析蛋白质印迹分析用蛋白质印迹分析法分析苦参碱对蛋白表达的影响用苦参碱处理后，用 Tekmar 声波干扰器（功率设定 60）连续三次超声 10S，悬浮和贴壁的细胞溶解在缓冲液 A 中（10mol 盐酸缓冲液，1molEDTA，10%甘油，1mg / ml 的亮肽素，2 μg/ml 抑肽酶和3.28 mg/ml 的苯甲基磺酰氟） 用 SDS‑PAGE（5％积层凝胶，10％分离胶）分离蛋白，并用半干印迹装置将蛋白转移到硝酸纤维素薄膜在室温下用 5%的脱脂奶粉培养过夜，然后用 TBST 洗涤三次，每次 5min保持室温，然后用与 Bcl-2，Bax 胱天蛋白酶 3 或-9 或 β肌动蛋白结合的抗体滴定 1h,随后如之前所述洗涤薄膜，并在室温下用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠免疫球蛋白 G 或山羊抗免疫球蛋白 G 培养 1h.用TBST 将膜洗涤三次，在用 ECL 试剂盒检测用光密度计定量免疫反应带强度统计分析统计分析结果用 SD 值表示，用方差分析（ANOVA）和 t 检验法评价统计学显著性，P<0.05 表示存在统计学显著性差异结果结果苦参碱对苦参碱对 HT29HT29 细胞生长的抑制作用细胞生长的抑制作用苦参碱对 HT29 细胞的抗增殖作用用 MTT 法检测，结果表明在体外随着浓度增加，苦参碱浓度为 2-32 mg/ml 分别处理 24,36,48h,HT29细胞依赖时间和剂量它的增殖作用被显著抑制。

P<0.05; 表 I 和图 2).苦参碱诱导苦参碱诱导 G0/G1G0/G1 细胞周期阻滞细胞周期阻滞为了检测苦参碱对细胞周期的影响，细胞不用苦参碱处理或用制定浓度的苦参碱(4, 8 or 16 mg/ml)处理，用流式细胞仪细胞分析细胞周期分布如图 3，苦参碱依赖剂量显著增加 G0/G1 期染色细胞数量，并减少 G2/M 期细胞染色数量，说明苦参碱在 G0/G1 期抑制HT29 细胞生长，这导致 S 期和 G2/M 期的细胞数量大大减少细胞凋亡检测细胞凋亡检测在细胞凋亡早期，细胞膜产生微扰，并导致磷脂酰丝氨酸在细胞外的再分配，膜联蛋白 V 选择性的与磷脂酰丝氨酸结合从而使用荧光素标记的膜联蛋白 V 试剂盒确定发生凋亡的细胞用膜联蛋白 V-FITC/ PI 双染法检测 HT29 细胞的凋亡同时用碘化丙啶将细胞染色以区分早期凋亡细胞和坏死细胞 利用流式细胞仪收集 10000 个事件，细胞的成活率，死亡率和凋亡率按照方法中所述测定，结果显示在图 4.存活的细胞位于左下角（膜联蛋白 V-FITC 和 PI 阴性），早期凋亡细胞位于右下角（膜联蛋白 V-FITC 阳性），凋亡晚期的细胞细胞膜和细胞核逐渐破损，位于右上角（双阳性）。

细胞色素细胞色素 C C 从线粒体到细胞质的释放从线粒体到细胞质的释放为了对某些凋亡刺激物有所响应，细胞色素 C 从线粒体释放到细胞质，在细胞质中细胞色素 C 与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf 1）结合以促进凋亡小体的合成和半胱天冬酶-9 的激活在细胞凋亡的级联反应中，细胞色素 C 从线粒体释放是一个关键的步骤，这是因为它能够激活下游的半胱氨酸蛋白酶因此，苦参碱处理 HT29 细胞后，用蛋白印记分析法考察细胞色素 C 粒体和细胞质的分布如图5 所示，可以观察到，随着苦参碱浓度的增加，细胞色素 C 在细胞质的含量增加同时粒体的含量减少BaxBax 和和 BclBcl- -2 2 蛋白的表达蛋白的表达为了掌握苦参碱在人类结肠癌细胞 HT29 中抗细胞增殖的机制，需要考察凋亡相关蛋白的表达（图 5）蛋白印记分析法证实，苦参碱浓度在 4-16 mg/ml 范围内，随着剂量下调 Bcl-2 蛋白并上调 Bax 蛋白，最后导致 Bcl-2/Bax 蛋白比率减小研究表明，Bcl‑2 蛋白和主要的抑制剂 Bax 蛋白是细胞增殖和细胞凋亡的关键调节剂Bcl-2 蛋白表达过度会通过抑制细胞凋亡而增加细胞存活率，而 Bax蛋白过度表达会加速细胞凋亡。

苦参碱引起诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期，降低 Bcl-2/Bax 的蛋白比率，这可能是苦参碱抗癌细胞增殖的一个重要机制半胱天冬酶半胱天冬酶-3-3 和半胱天冬酶和半胱天冬酶-9-9 的活化的活化对裂解和长链的半胱天冬酶-9 的蛋白印记分析得出，用不同浓度 4, 8 16 mg/ml 的苦参碱处理细胞 24h 后，苦参碱会逐渐诱导半胱天冬酶-9 增加（图 6），苦参碱剂量为 16 mg/ml 时裂解的半胱天冬酶-9碎片的数量达到平稳，碎片出现并伴随着长链酶的减少，而在对照提取物组中未检测到碎片半胱天冬酶-3 直接激活半胱天冬酶-9，同样要对它检测用苦参碱处理后，在第 24h 检测到 17 kDa 裂解的半胱天冬酶-3，并观察到裂解碎片数量增加讨论讨论癌症的化学预防被定义为使用无毒的化学物质抑制，延缓或逆转致癌的过程，它被视为控制癌症发展的一个很有前景的方法据报道多种化合物可以防止化学致癌，并作为癌症的化学预防药物在这些化合物中，苦参碱是一个有前景的植物化学药物，它在癌症多阶段具有化学预防活性，苦参碱是一种天然的多酚类植物抗毒素，动物体内实验证明它具有癌症化学预防活性1958 年苦参碱首次从苦参中分离并确定，在中国作为一种抗癌的治疗药物而被广泛使用。

苦参碱低毒副反应小，可以用于儿童和婴儿然而，据我们所知，苦参碱对胰腺癌的作用之前并未报道细胞增殖的不可控性是癌细胞一个重要的生物特征，通过抑制细胞增殖可以抑制肿瘤的生长本次研究就是要考察是否苦参碱可以减小肿瘤细胞的增殖速率MTT 实验表。