烟草组培苗实验步骤.docx

烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体 的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织 再分化形成植物体从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期： 起动期、分裂期和形成期植物材料：烟草植株药品：(2,4-D、NAA、6-BA 浓度均可)、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70% 酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0)、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无 菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工 作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤1、MS培养基母液的配制母液成分规定量(mg/L)浓缩 倍数称取量(mg)母液定溶 体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)编 号种类1大量元素KNO319001019000100010NH4NO316501016500MgSO4 ・7H2O3701037000KH2PO41701017002CaCl2 • 2H2O4401044001000103微量元素MnSO4 ・4H2O22.31002230100010ZnSO4 • 7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4 • 7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.05010050010盐酸毗哆醇0.55025盐酸硫铵素0.1505烟酸0.550256肌酸10050500050010注意：1、 大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除 CaCl2 - 2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒 搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化 合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2・2H2O配制同上置于另一 小口瓶中。

2、 微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4 - 7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量 蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签3、 铁盐配制将FeSO4 - 7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加 热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml， 置于小口瓶中，贴上标签4、 有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其 余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签5、 母液最好在2~4°C的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长， 无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用1） 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化 学药品必须是高纯度的（分析纯）2） 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液， 这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA）， 吲噪乙酸（IAA），赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量 95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热激动素（KT）和6-苄基嘌吟（BA） 可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫 升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4C ）保存，配制培 养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液 即可三、培养基配制和灭菌本次实验使用（1） 愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L ；（2） 幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（3） 生根培养基：MS+NAA0.2 mg/Lo注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应 激素所得，MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8,培养温度25±2°C,光照强2000lx。

母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1：母液吸取量=母液体积（CC）X（配制培养基的升数/母液浓缩倍数）公式2：母液吸取量=（培养基要求的含量/母液每CC的含量）（各种生长 调节剂）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F.生长素萘乙酸（NAA）:配制0.5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸馏水定容至1000ml； G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT 用少量1N HCL溶解后，加蒸馏水定容至100ml配制培养基（1000ml）1. 琼脂:称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏 水中3. 各种母液的吸取（培养基1L）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2 - 2H2O母液（B）各100ml（2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（H） 10ml（4） 移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80C左右， 用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH 一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用 1N NaoH 和 1N HCL 调整。

分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个 三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右） 注：培养基勿碰瓶壁包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝 锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处四、培养基的灭菌一一高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）具体操作步骤：1. 高压锅放水至平把架；2.把包扎好的培养基装入高压锅；3. 盖上热压锅盖，上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.4. 然后接通电源.5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀，排除冷空气（此步很重要）6. 排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间， 具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa 时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅 内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养 基取出。

8, 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培 养基有无微生物污染，可将培养基置于25°C下保存4天，如果培养基需要贮存 较长时间，可在4°C低温下保存灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论 哪种型号，操作的步骤都很相近进水f放进培养基f盖紧锅盖f关上放汽阀f检查安全阀f接上加热源f 待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀f 0.11MPa（121 C）下灭菌 20~25分钟，保持稳定压力f除热源f逐渐打开放气阀f锅内空气排除完后f开 放锅盖f稍冷后取出培养基五、 植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物这些污染源一 旦带入培养基，便会造成培养基污染因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处 理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种1、接种步骤：第一步：清理材料ff流水冲洗f—加入吐温（或洗衣粉）清洗ff自来水冲 洗第二步：对材料的表面浸润灭菌：70%酒精浸10-30秒ff无菌水第三步：灭菌剂处 理ff 0.1-1%升汞5-8 min （或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗 注意、事项：1. 灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存。

2. 对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次，升汞一般5-8次，每次不少 于 3min3. 灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底4. 灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止5. 灭菌液要充分浸没材料2、无菌操作可按以下步骤进行：（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进 行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3） 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台 后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处然后搽拭工作台面；（5） 先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反 复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6） 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割如 叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段微茎尖要剥成只含1-2片 叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染7） 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种， 每5天要大强度灭菌一次六、 烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化（1）于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍 3min；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分 割为1-1.5cm2的小块；接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。

接入（1） 中培养2） 约2〜3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；（3） 15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率 为 100%（4） 30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点（5） 60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率（芽数/块愈伤 组织）为25〜35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不 同程度白化（或缺绿）但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽 增殖培养基（2）上6） 3〜5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮 的小苗七、诱导生根及移栽与数据记录取约3〜4cm长的无根小苗接种。