济宁青山羊毛囊发育特性与egf、igf2基因差异表达的研究.pdf

山东农业大学 硕士学位论文 济宁青山羊毛囊发育特性与EGF、IGF2基因差异表达的研究 姓名：王睿智 申请学位级别：硕士 专业：基础兽医学 指导教师：尹逊河;王慧 2011-04-25 山东农业大学硕士学位论文 1 济宁青山羊毛囊发育特性与济宁青山羊毛囊发育特性与 EGF、、IGF2 基因差异表达的研究基因差异表达的研究 中文摘要 济宁青山羊是山东省优良地方品种，主要分布于鲁西南地区，以性成熟早、繁殖率 高和羔皮品质好而著称其主要产品是猾子皮羔羊生后 3 日以内屠宰后得到的猾子皮 称为小猾皮，生后 30 日以内屠宰后得到的猾子皮称为大猾皮青猾皮具有天然独特的 色彩和花纹，毛色品质好，光润，皮板轻巧而美观，由猾子皮所制的翻毛皮衣和帽领驰 名中外，在国际市场上享有盛誉本实验通过对青山羊的毛囊发育特性以及差异表达基 因的研究，可以对青山羊的遗传育种、改良青猾皮品质等方面提供可靠的依据 本实验首先采用组织学的方法， 系统地研究了济宁青山羊出生后不同发育阶段皮肤 毛囊组织学特性，包括毛囊的形态特征、毛囊群的分布、毛囊数量与毛囊直径等结果 表明：随着年龄的增长，毛囊群中次级毛囊的数量稍有增加(P>0.05)，初级毛囊的数量 稍有下降(P>0.05)；初级毛囊直径在出生后随日龄稍有增大，但差异不显著(P>0.05)，而 次级毛囊直径在 2 月龄之前极显著地增大(P0.05)，说明，初级毛囊在出生前已基本发育完成，而次级毛囊在出生后会继续 发育。

进一步采用荧光定量反转录 PCR 技术，分别研究了不同发育阶段的表皮生长因子 (EGF)和类胰岛素生长因子-2(IGF-2)的差异表达研究结果表明：EGF 表达量在出生后 呈持续升高趋势，至 2 月龄达到最高，不同月龄间差异极显著(P<0.01)，之后表达量持 续下降，但仍有表达IGF-2 在胎儿期表达量最高，同其他发育阶段相比差异极显著 (P<0.01)，出生后表达量持续下降，1 月龄表达量最低 最后通过 SAS9.0 分析软件进行差异表达基因与毛囊发育特性之间相关性分析，结 果显示：出生后至 2 月龄期间，EGF 的表达量与次级毛囊的直径之间呈极显著正相关 (P0.05). The diameter of secondary follicle were increased very significantly (P<0.01). The diameter of secondary follicle grows to the biggest of 2-month-old. It indicated that primary follicle were developed before born and secondary follicle were still developed after born. QRT-PCR were used to detect the different expression of EGF and IGF-2. The consequence indicated that the expression of EGF increased after birth and achieved the highest in the 2-month-old (P<0.01). It decreased very significantly after 2-month-old (P<0.01). And the expression of IGF-2 achieved the highest in the fetus, it decreased very significantly after born (P<0.01). SAS9.0 were used to detect the different expression genes and development of hair follicle. The consequence indicated that the expression of EGF and the diameter of secondary follicle had significant positive correlation before 2-month-old (P0.05)；S/P 变化差异不显著(P>0.05)，从出生后基本 保持恒定，平均值为 4.97。

2.1.2 毛囊直径 初级毛囊的直径在出生后随着日龄稍有增大，但差异不显著(P>0.05)；次级毛囊在 出生后至 2 月龄之间，直径极显著增大(P0.05)，具体数值如表 1-2 所示 济宁青山羊毛囊发育特性与差异表达基因研究 18 表 1-2 济宁青山羊不同发育阶段毛囊直径(μm) Table 1-2 Diameter of different development stages of Jining Gary Goat (μm) 日龄 Ageindays 初级毛囊直径 Diameter of primary follicle 次级毛囊直径 Diameter of secondary follicle 1 日龄 1-day-old 80.790.46A 29.11.4a 1 月龄 1-month-old 81.160.70A 39.060.64b 2 月龄 2-month-old 81.310.16A 48.870.56c 3 月龄 3-month-old 81.620.18A 49.020.16c 4 月龄 4-month-old 81.610.16A 50.010.32c 5 月龄 5-month-old 81.930.01A 50.810.28c 注：同一列中相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异极显著（P0.05), different letter demonstrate extremely significant (P0.05） ，S/P 基本保持恒定；次级毛囊的直径极显著增大（P0.05)；初级毛囊直径在出生后稍有增大，但差异不显著(P>0.05)，而次级 毛囊直径在 2 月龄之前极显著增大(P<0.01)，在 3 月龄以后，毛囊直径等指标逐渐趋于 恒定。

由此我们推断，初级毛囊在出生前就已全部发育形成，而次级毛囊在出生后继续 发育，至 3 月龄以后，次级毛囊的发育也基本完成这与其他相关研究的结果相似（张 燕军，2006；王树迎，2001） 济宁青山羊毛囊发育特性与差异表达基因研究 20 试验二 济宁青山羊不同发育阶段 EGF 差异表达研究 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验动物 课题组于 2009 年 3～4 月选择健康、营养状况良好的济宁青山羊成年母羊 16 只， 公羊 2 只，全部由山东省济宁市梁山县科龙畜牧公司提供购买的济宁青山羊均饲养在 山东农业大学南校区动物科技学院实验站的羊场内，饲喂条件保持一致，人工配种，使 其怀孕产仔随机选取不同发育阶段的青山羊各 3 只 1.1.2 样本采集与固定 背侧部皮肤局部剪毛、清洗、碘酊和酒精消毒，剪取约 1.5cm2 的皮肤组织样，立 即用 DEPC 水配制的 70%酒精冲洗，放入 1.5ml 离心管后，装入纱布袋，迅速投入液氮 罐，并及时转入-70℃超低温冰箱中低温冷冻保存 1.1.3 试验仪器设备及试剂 1.1.3.1 试验用仪器设备 荧光定量 PCR 仪 （MX3000P， Stratagene） ； 梯度 PCR 仪 （5331 型， 德国 Eppendorf ,） ； 普通 PCR 仪（5332 型，德国 Eppendorf ） ；多容量组移液器（德国 Eppendorf 公司） ； 超速离心机（德国 Eppendorf） ；超速冷冻离心机（Centrifuge 5804R，德国 Eppendorf） ； 迷你离心机（LX-200，海门市其林贝尔仪器公司） ；漩涡混合器（V-2G，美国）稳压电 泳仪(DYY-12 型，北京六一仪器厂)；凝胶成像系统（JY04S-3A,B，君意东方） ；制冷机 （AF200 PSC 50R，美国） ；超纯水系统（PL5243，ELGA） ；分光光度计（德国 Eppendof 公司） ；微波炉（Galanz，广东格兰仕集团有限公司） ；高压蒸汽灭菌器（MLS-3780 型， SANYO 公司） ；干热灭菌箱（DGF801，湖北省黄石市医疗器械厂） ；分析天平（BS224s 型， Sartorius 公司） ； 恒温振荡器 （TH2-C 型， 江苏太仓市试验设备厂） ； 恒温水浴锅 （HH-2， 山东农业大学硕士学位论文 21 国华电器有限公司） ；超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司） ；恒温鼓风干燥箱 （DHG-9070A 型， 上海一恒科技有限公司） ； 超低温冰箱 （MDF-U40866， 日本 SANYO） ； 低温保存箱（Haier，中国青岛） ；液氮罐（YDS-3，乐山市东亚机电工贸有限公司） 。

1.1.3.2 试验用试剂的来源 （1）总 RNA 提取试剂盒：TRIZOL Reagent：Bioteke 公司 （2）不含 RNA 酶的 DNA 酶 1：Takara 公司 （3）人胎盘 RNA 酶抑制剂：Promega 公司 （4）SuperScriptTM Reverse TranscriptaseⅢ（200U/μL） ：Invitrogen 公司 （5）DEPC（焦碳酸二乙酯） ：Sigma 公司 （6）无水乙醇、异丙醇、氯仿等常规试剂均为国产分析纯 （7）Taq DNA 聚合酶：Takara 公司 （8）dNTP（250μmol/L） ：Takara 公司 （9）75％的乙醇：0.1％DEPC 处理水配制 （10）琼脂糖：Promega 公司 （11）定量试剂盒：Toyobo （12）M-MLV 反转录酶，200U/μl：Promega 公司 （13）PCR Marker DL2000；DL1000：Takara 公司 1.1.3.3 试验用试剂的配制及处理 （1）0.5mol/L，EDTA（pH8.0） ：在 800mL 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-Na2H2O） ，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0，然后定 容至 1000mL，高压灭菌。

（2）1mol/LTrisCL：121.14g Tris 碱溶于 800mL 双蒸水中，用盐酸调 pH 值至 8.0，定 容至 1000 mL，高压灭菌 （3）50TAE 缓冲液：Tris 碱 242g，冰乙酸 57.1mL，0.5mol/L EDTA（PH8.0）100mL， 加水至 1000 mL （4）10TBE 缓冲液：Tris 碱 108g，硼酸 55g，0.5mol/L EDTA（PH8.0）40mL （5）10% SDS：SDS100g 溶于 900ml 双蒸水中，加热至 68℃助溶，用 HCl 调 pH 值至 济宁青山羊毛囊发育特性与差异表达基因研究 22 7.2，定容至 1000ml （6）GAPDH 引物溶解稀释：上游引物加蒸馏水 52ul，下游引物加蒸馏水 60ul，配成 100uM 的贮存液 （7） EGF 引物溶解稀释： 上游引物加蒸馏水 48ul， 下游引物加蒸馏水 47ul， 配成 100uM 的贮存液 （8）5RT buffer：250mM Tris-HCl（pH8.3） ，375mM KCl，15mM MgCl2 （9）dNTP（250μM） ：Pharmarcia, 0.1％DEPC 处理水配制。

1.2 试验方法 1。