第十一讲蛋白质的分离与纯化二.ppt

二、简述题（每题二、简述题（每题1010分共分共4040分）分）1.1.蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？2.2.如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？3.3.什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法4.4.预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的操作流程操作流程当前1页，共35页，星期日第一页，共三十五页三、方案设计（三、方案设计（三、方案设计（三、方案设计（1010分）分）分）分）某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对热稳定性较差，进入某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对热稳定性较差，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否提高人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否提高蛋白质的稳定性，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理。

蛋白质的稳定性，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰四、论述题（四、论述题（20分）：分）：论述蛋白质一级结构测定的基本程序以及主要方法和原理论述蛋白质一级结构测定的基本程序以及主要方法和原理当前2页，共35页，星期日第二页，共三十五页概述概述常见色谱技术介绍常见色谱技术介绍第四节第四节 精制分离精制分离液相色谱技术液相色谱技术当前3页，共35页，星期日第三页，共三十五页1、液相色谱（、液相色谱（Liquid chromatography）？）？l利用不同物质在固定性和流动相中的分配特性不同，对物质的分离的技术利用不同物质在固定性和流动相中的分配特性不同，对物质的分离的技术理解）（理解）依据物质的理化特性依据物质的理化特性（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）不同，不同，在固定性和流动相中的分配系数不同在固定性和流动相中的分配系数不同流动相为平推流流动相为平推流流动相流过固定相时，两相之间分配平衡很快流动相流过固定相时，两相之间分配平衡很快不同物质的流动速度不同而实现分离。

不同物质的流动速度不同而实现分离又称为层析（平推流）又称为层析（平推流）l特点特点（四高）（四高）高效率、高纯度、高精度、高自动化程度高效率、高纯度、高精度、高自动化程度现代化色谱技术现代化色谱技术高效液相色谱高效液相色谱一、概述一、概述当前4页，共35页，星期日第四页，共三十五页1850年，年，德国化学家德国化学家Runge将古罗马时期分析将古罗马时期分析染料与色素染料与色素的方法进行改进的方法进行改进，发展成为发展成为纸色谱1903年，年，俄国植物学家俄国植物学家 Tsweet 在华沙生物学会议上在华沙生物学会议上发表分离发表分离植物色素植物色素的论文，的论文，1906年，年，Tsweet首次首次提出提出提出提出“色谱法色谱法” 和和“ 色谱图色谱图”的概念色谱法色谱法”（Chromotography） “ 色谱图色谱图” （Chromatogram）1941年，年，英国生物化学家英国生物化学家Martin与与英国化学家英国化学家Synge （获诺贝尔奖）创立液液分配色谱，（获诺贝尔奖）创立液液分配色谱，以水份饱和硅胶为固定相，含以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸。

分离乙酰氨基酸1970年中期，微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析精度年中期，微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析精度80年代，色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了色谱年代，色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了色谱光谱联用、色谱光谱联用、色谱质谱联用、二维色谱（色谱质谱联用、二维色谱（色谱色谱）色谱）等技术1990年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了高效液相色年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了高效液相色谱技术的发展谱技术的发展 2、 液相色谱法的发展液相色谱法的发展当前5页，共35页，星期日第五页，共三十五页在色谱技术中，液相色谱（在色谱技术中，液相色谱（Liquid chromatographyLiquid chromatography）是最早（）是最早（19031903年）发明的，但其初期发展比较慢年）发明的，但其初期发展比较慢液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。

2020thth60S60S，将较为成熟的气相色谱，将较为成熟的气相色谱 理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展特别是特别是填料填料填料填料（色谱柱）制备技术、（色谱柱）制备技术、检测检测检测检测技术和技术和高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化了高效化和高速化19691969年，液相色谱仪商品化从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为高效液相色谱法年，液相色谱仪商品化从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为高效液相色谱法（HPLCHPLC）更加更加 微量、快速、高效、广泛微量、快速、高效、广泛新进展：新进展：微柱微柱HPLCHPLC、无孔色谱短柱、无孔色谱短柱HPLCHPLC、毛细管、毛细管HPLCHPLC2、液相色谱的发展、液相色谱的发展当前6页，共35页，星期日第六页，共三十五页1.吸附层析吸附层析 adsorption chromatography2.分子筛层析分子筛层析 molecular sieve chromatography3.离子交换层析离子交换层析 ion exchange chromatography4.亲和层析亲和层析 affinity chromatography5.分配色谱分配色谱液液-液色谱液色谱6.疏水色谱疏水色谱疏水作用疏水作用7.等电点聚焦色谱等电点聚焦色谱pI8. 8.高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高度自动化的液相色谱高度自动化的液相色谱高度自动化的液相色谱高度自动化的液相色谱3、液相色谱的类型、液相色谱的类型当前7页，共35页，星期日。

第七页，共三十五页1 1、吸附分离色谱？、吸附分离色谱？（1 1）概念：）概念：利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术2 2）原理：）原理：通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同通过连续的吸附通过连续的吸附解吸附解吸附再吸附过程将物质分离再吸附过程将物质分离 二、常见色谱介绍二、常见色谱介绍当前8页，共35页，星期日第八页，共三十五页3）影响因素？）影响因素？吸附剂、溶剂、被分离物质的性质吸附剂、溶剂、被分离物质的性质“三方面三方面”l吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用的固体物质吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用的固体物质l吸附剂选择原则：吸附剂选择原则：l根据：吸附剂性质、溶剂的性质、被分离对象的性质根据：吸附剂性质、溶剂的性质、被分离对象的性质选择l表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。

表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉l如何理解如何理解选择原则？（三者之间相互影响关系）：选择原则？（三者之间相互影响关系）：l极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质l为了便于解吸附，对于极性大的分离物，选择极性较小的吸附剂，反之亦然为了便于解吸附，对于极性大的分离物，选择极性较小的吸附剂，反之亦然 l极性吸附剂、分离弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性物质、用强极性溶剂极性吸附剂、分离弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性物质、用强极性溶剂l理想吸附剂和溶剂的选择：依据原则，依靠经验和多次试验理想吸附剂和溶剂的选择：依据原则，依靠经验和多次试验l常用吸附剂：常用吸附剂：l硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等l硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）l氧化铝：多孔氧化铝：多孔Al2O3，分三种：酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝，分三种：酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝l活性炭：非极性吸附剂、常用于脱色和脱臭等吸附过程活性炭：非极性吸附剂、常用于脱色和脱臭等吸附过程当前9页，共35页，星期日。

第九页，共三十五页l层析方式（层析方式（2 2种）：种）： 柱柱柱柱层层层层析析析析：羟羟基基磷磷灰灰石石（HAHA），CaCa3 3(PO(PO4 4) )3 3OHOH2 2 ，酸酸性性蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸、病病毒毒等等生生命命大大分分子子硅硅胶胶：含含硅醇基团（硅醇基团（-Si-OH-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等分离并洗脱），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等分离并洗脱）薄层层析薄层层析薄层层析薄层层析：（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析u 硅胶薄层层析：硅胶薄层层析：硅硅胶胶板板分分类类（4 4类类），硅硅胶胶H H（纯纯硅硅胶胶），能能用用腐腐蚀蚀性性强强的的显显色色剂剂；硅硅胶胶G G（10%-15%10%-15%煅煅石石膏膏和和5%5%淀淀粉的硅胶）粉的硅胶）；硅胶；硅胶CMCCMC（含羧甲基纤维素）；硅胶（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254HF254( (含荧光剂的硅胶含荧光剂的硅胶H)H) 硅硅胶胶板板的的制制备备：玻玻璃璃板板，硅硅胶胶制制备备（加加溶溶剂剂碾碾磨磨），铺铺板板，活活化化和和合合格格检检查查：约约1mg1mg苏苏丹丹黄黄、苏苏丹丹红红和和靛靛酚酚蓝蓝混混合合物物乙乙酸酸乙乙酯酯溶溶液液点点样样，苯苯：展展层层剂剂，RfRf：苏苏丹丹黄黄 苏苏丹丹红红 靛靛酚蓝，苏丹黄酚蓝，苏丹黄RfRf约约0.50.5，苏丹红和靛酚蓝，苏丹红和靛酚蓝RfRf之差在之差在0.10.20.10.2。

分析程序：点样，展层，显色分析程序：点样，展层，显色当前10页，共35页，星期日第十页，共三十五页u聚酰胺薄膜薄层层析：聚酰胺薄膜薄层层析：如：如：DNS氨基酸分析，氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度10-910-10mol/LDNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应和氨基酸或多肽在特定条件下反应DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列Edman降解试剂降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶。