高效液相色谱法进展及其在卫生检验中的应用孙成均课件.ppt

Sichuan University四川大学华西公共卫生学院 孙成均高效液相色谱技术进展及其在卫生检验中的应用 Sichuan University介绍的主要内容n概述n高效液相色谱仪组成及进展n从色谱图的异常推测故障n高效液相色谱法在卫生检验中的应用 Sichuan University一、概述高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代发展起来的一种分离分析技术，在色谱技术中应用最广据估计，世界上数百万种有机化合物中除20%宜用气相色谱法(GC)分离分析外，其余80%（包括大分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物）均可用HPLC分离分析自1980年代以来，HPLC 成为国际分析化学界发展最快的一种分离分析技术，在工农业、医药卫生、环境监测等众多领域有广泛应用 Sichuan University液相色谱的发展简史1903年，俄国植物学家Tswett在华沙大学研究植物叶组成时，用碳酸钙作吸附剂分离植物叶石油醚萃取物；是最早的液固色谱液固色谱法1931年，德国Kuhn和Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了α，β和γ－胡萝卜素；此后用这种方法分离了60余种这类色素；1970年代初；高压泵和化学键合固定相结合，出现高高效效液液相相色色谱；谱；1970年代末，出现反相色谱柱反相色谱柱；1980年代得到广泛应用；1980年代末，出现毛细管超临界流体色谱毛细管超临界流体色谱和毛细管电泳毛细管电泳。

 Sichuan University液相色谱基本原理 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出又称为色层法、层析法 Sichuan University分离原理示意图慢慢中等中等快快淋洗液淋洗液 Sichuan University二、高效液相色谱仪组成及进展HPLC 仪器一般由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和计算机控制及数据处理系统(工作站)组成 Sichuan University1．输液系统n对高压输液泵的要求： 密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求；可调范围宽，既能满足微柱(内径1～2mm)分析，也能满足常规柱(内径4mm)分析，甚至还可满足半制备柱(内径10mm)的需求n目前HPLC 常用的是双泵头往复式柱塞双泵头往复式柱塞泵泵，流速范围一般为0.001～10ml/min它是由两个泵头交替工作来保证系统中液流不中断 Sichuan University往复式柱塞泵 Sichuan University洗脱方式n等度洗脱（等度洗脱（Isocratic Elution）：）：溶剂组成恒定，在整个洗脱过程，流动相极性保持恒定。

n梯度洗脱（梯度洗脱（Gradient Elution）：）：流动相组成和极性随洗脱过程而改变  Sichuan University流动相组成变化对保留时间的影响 Sichuan University等度洗脱分离芳香化合物等度洗脱分离芳香化合物色谱条件：色谱柱为250mm× 4.6mm，5um Hypersil ODS柱温：22℃；流动相A为缓冲液（25mM KH2PO4＋0.1g/L NaN3，pH3.5）；B为乙腈峰1、苯甲醇；峰2、苯酚；峰3、3,4-二羟基-氯代苯乙酮；峰4、安息香胶；峰5、苯甲酸乙酯；峰6、甲苯；峰7、2,6－二甲氧基甲苯；峰8、间－甲氧基联苯 Sichuan University Sichuan University泵的保养与维护n高纯流动相（甲醇、乙腈、水、缓冲盐等）；n流动相进液砂芯过滤头要经常清洗；n流动相交换时要防止沉淀； n避免泵内堵塞或有气泡；n每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染 Sichuan University2．进样六通阀美国Rheodyne 进样阀 Sichuan UniversityHPLCHPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。

美国Rheodyne公司的六通阀进样器应用最广 Sichuan University进样六通阀使用注意事项n 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，转到进样位时，高压力引起柱头损坏，故应尽快转动阀，不能停留在中途n在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器该针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性好，不漏液，不引入空气；还可防止了针头刺坏密封组件及定子 Sichuan University对进样液的要求n样液要无微粒杂质样液，一般要经0.45 μm滤膜过滤或高速离心以防堵塞针头及进样阀，减少对进样阀的磨损n为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 Sichuan University3. 色谱柱 色谱柱通常为不锈钢柱，内装不同填充剂常用填料为硅胶，可用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相色谱或正相色谱其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS 柱（octadecylsilica column），可用于反相色谱或离子对色谱。

 Sichuan University高效液相色谱柱发展史n1970年代，HPLC柱面世，主要填料：10 µm 的无定型硅胶颗粒n1970年代后期，发展了反相液相色谱n1980年代，HPLC已广泛应用，主要填料粒径5 ～ 10 µm 球形硅胶n1990年代早期，发展了粒径为 5 µm 的高纯硅胶（ B 型硅胶），其含有微量的金属（A型硅胶含有高含量金属）n1990年代后期，发展了 3 µm 或 3.5 µm 的球形硅胶n2000年后，为适应超快速分离要求，开发出小于 2 µm 的填料，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶 Sichuan University正相色谱（normal phase chromatography ） 采用极性固定相如聚乙二醇、氨基与腈基键合相；流动相为相对非极性的疏水性溶剂烷烃类如正已烷、环已烷，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间常用于分离中等极性和极性较强的化合物如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等 Sichuan University反相色谱（reversed phase chromatography） 以非极性载体为固定相，以极性较强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。

在分离中，多以含一定量甲醇或乙腈等与水互溶的有机溶剂作流动相现在所用反相柱中C18占65%; C8占15%; 氰基柱占5%, 苯基柱 <5%  Sichuan University常用固定相基质材料n聚合物基质：交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯用量很小（3%）n硅胶基质：如如C18（十八烷基硅烷,ODS）、C8（辛基硅烷）、氰丙基硅烷、苯基硅烷、C4（丁基硅烷）、C2（乙基硅烷）、C1（甲基硅烷）其中C18用量达65％ Sichuan University聚合物基质材料及其特点npH 范围宽（1－13）；n可在较宽范围内进行表面化学处理以满足不同色谱分离的需求；n在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形；n填料的体积随着流动相的不同而膨胀或收缩；n分离效率较硅胶基质材料的低；n重现性不好 Sichuan University硅胶基质材料及其特点n机械强度高，比表面积大；n可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求；n分离效率高；n重现性好；n适用范围pH范围为2～8；n具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。

 Sichuan University未经修饰硅胶的极性很强SiO2OHOHOHOHOH这种硅胶极性很强，可用于正相色谱分离正相色谱分离 Sichuan University硅胶表面的硅烷化（键合）十八烷基硅烷化的目的是除去硅胶表面残留的硅醇基但硅烷化过程并不完全，理论上只能达到40%十八烷基硅烷化 Sichuan University封端（去活化）采用三甲基氯硅烷三甲基氯硅烷 （trimethylchlorosilane，TMS) 或六六甲基二硅氮甲基二硅氮烷烷（hexamethyldisilazane，HMDS) 封端硅胶颗粒的键合度可用含碳量表示（％）endcapping Sichuan University为什么要封端（尾）？ 为减少残余硅醇基，提高键合相稳定性和改善峰性，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，该过程称封端封端（end-capping） 硅烷相对体积大，使C18和键合相在键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的 50% 未被键合硅胶表面的酸性硅羟基可与被测物作用，特别是在中性条件下对碱性化合物产生拖尾峰 封端消除表面残余的硅羟基，从而改善分离且产封端消除表面残余的硅羟基，从而改善分离且产生良好峰形。

生良好峰形  Sichuan University色谱柱与填料silica particles  Sichuan University硅胶纯度对分离的影响n硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要；nA 型硅胶：纯度较低的硅胶以金属硅酸盐制备而成，具有高的金属含量，金属杂质对螯合剂和碱性化合物分离产生不对称峰或拖尾峰可用于中性化合物和非离子化合物的分离；nB 型硅胶：纯度高、酸性较弱的硅胶以无金属工艺制备而成，只含微量金属，宜用于离子化合物和可电离化合物的分离，特别是碱性化合物 Sichuan University硅胶孔径对分离的影响孔径作用和效能< 60 nm对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60–150 nm对小分子的分离效果理想 (MW < 4,000 至 130,000)300–1,000 nm对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子> 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子 Sichuan University硅胶粒径对分离的影响粒 径作 用 和 效 能5 µm目前应用最广泛，可满足从分析到半制备的分离3 – 3.5 µm常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂< 2 µm常应用于超快速分离， 高通量, 分离度高7 – 10 µm常用于半制备色谱柱10 – 20 µm常用于制备色谱柱 Sichuan UniversityHPLC 色谱柱的种类类 型内径(mm)柱长(mm)粒径 (µm)微 孔 柱1-2.1150-2503-8分 析 柱3–4.630–2503-10半制备柱8–10100-2505-20制 备 柱20–50100-2505-20 Sichuan University理论塔板数与粒径和柱长的关系粒径 (µm)柱长 (cm)塔 板 数 N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,000理论塔板数计算式： Sichuan University不对称因子As与拖尾因子TfAs = 1.0-1.05 很 好As = 1.2 一 般As = 2 差As = 4 很差不对称因子不对称因子As和拖尾因子和拖尾因子Tf的关系的关系As (10%)Tf (5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0 10% 峰高5% 峰高 Sichuan University色谱柱柱效下降的原因n色谱柱塞板或柱床被堵塞——导致色谱柱压上升、峰形拖尾和柱效下降。

n吸附了样品杂质——导致柱效下降、选择性和保留时间改变n色谱柱没装填好——导致柱效下降和峰形拖尾n物理损伤或受热引起的缺口——导致柱效下降和峰形拖尾n对硅胶基质或键合相的化学腐蚀——导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强） Sichuan University色谱柱的保养n不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱；否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”n色谱柱和色谱仪相连时，阀件或管路定要清洗干净；n如无脱气装置，需将流动相脱气后使用；n避免使用高粘度溶剂作为流动相，否则增加柱压； Sichuan University色谱柱的保养n样液要提纯尽可能用色谱纯试剂另外使用预柱，可延长色谱柱寿命如流动相为水溶液，细菌易生长，加入0.04％Na3N能防止能防止细菌生长；n对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出2～8，使用温度不宜过高在酸性或碱性条件下使用后，应依次用水、甲醇清洗；n若柱子长期不用，应用适当有机溶剂保存并封闭 Sichuan University色谱柱的再生直接将色谱柱连接到泵，每种溶剂至少用20倍柱体积（如250mm×4.6mm柱约4.2ml）。

n极性固定相极性固定相(如Si，NH2，CN基色谱填料)的再生：正庚烷  三氯甲烷 乙酸乙酯  丙酮 乙醇 水n非极性固定相(如反相C18，C8等)的再生： 水 乙腈 三氯甲烷(或异丙醇) 乙腈  水 Sichuan University4. 检测器一般要求：检测器用于连续检测从色谱柱流出的物质，以进行定性定量分析要求其灵敏、响应快、噪声低、基线稳定、线性范围宽等 Sichuan University紫外检测器(UVD) 普通紫外检测器用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池 二极管阵列检测器(diode array detector, DAD)，由311-1024个二极管组成它以光电二极管阵列为检测元件先让全波长光通过流动池，然后通过一系列分光技术，使光在接受器上被检测，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到时间、光强度和波长的三维谱图DAD可提供部分定性信息，可进行色谱峰的纯度分析，消除漂移，分离杂质，准确定量 Sichuan University紫外－可见光检测池 Sichuan University二极管阵列检测器及三维光谱图 Sichuan University荧光检测器（（fluorescence detectorfluorescence detector，，FLDFLD））荧光检测器原理：物质的分子或原子经光照射后，被激发至较高能态，但不稳定很快又从高能态 跃迁至低能态，同时发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧光。

在其他条件一定的情况下，荧光强度与物质的浓度成正比  Sichuan University示差折光检测器原理n示示差差折折光光检检测测器器是基于纯溶剂（流动相）的折射率与柱流出物（含溶质的流动相）的折射率存在差异的原原理理，连续地检测柱流出物折射率变化的检测器 特点：通用性强，操作简便；但灵敏度低，不适用于梯度洗脱  Sichuan University示差折光检测器(refractive index detector(refractive index detector，，RID)RID) 偏转式示差折光检测器原理图偏转式示差折光检测器原理图经过流通池的折射光被透镜聚焦，在光电检测器上产生与光电位置成正比的电信经过流通池的折射光被透镜聚焦，在光电检测器上产生与光电位置成正比的电信号检测室和参比室折射率相同或不同时，光偏转角度不同，到达光电检测器上号检测室和参比室折射率相同或不同时，光偏转角度不同，到达光电检测器上光点位置发生变化，从而产生大小不同的微弱光电流，经放大后记录下来光点位置发生变化，从而产生大小不同的微弱光电流，经放大后记录下来 Sichuan University蒸发光散射检测器(ELSD)n工工作作原原理理：将色谱柱流出液引入雾化器与通入的高纯氦混合形成均匀微小液滴，经加热蒸发除去流动相。

而样品组分形成气溶胶，进入检测室用激光照射气溶腋，产生光散射，用光电二极管检测散射光n该检测器适用于挥发性低于流动相的组分，可用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等；但灵敏度较低，要求流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐类 Sichuan University蒸发光散射检测器 Sichuan University电化学检测器(electrochemical detector，ECD) ECD 为一种灵敏的检测器根据电化学原理，色谱柱流出物的响应值随电位的变化而不同，在一定电位条件下，可得到不同保留时间的色谱图，灵敏度可达pg水平  Sichuan University质谱检测器(mass detector，MSD) 质谱把待测物质分子转变成带电粒子，利用稳定磁场(或交变电场)使带电粒子按质质荷荷比比大小顺序分离开，形成有规则并可以检测的质量色谱该法对单一组分有很强的鉴别力 HPLC和MS联用的关键是接接口口(Interface)由于HPLC流动相的组成比GC载气复杂，因此，对HPLC-M S的接口技术则要求更高。

 Sichuan University液相色谱－质谱联用仪 Sichuan UniversityHPLC现有的主要接口热喷雾接口(Thermospary，TS) 由HPLC色谱柱流出的极性溶液进入不锈钢毛细管后，经加热蒸发呈带正电荷的雾滴/气溶胶，在一定能量下，溶剂则被油泵抽走，正离子进入离子源 适合于含有大量水的流动相，可用于测定各种极性化合物 Sichuan University 将色谱流出物转化为气溶胶，于脱溶剂室脱去溶剂，得到的中性待测物分子导入离子源，使用电子轰击或者化学电离的方式将其离子化，获得的质谱为经典的电子轰击电离或者化学电离质谱图适用于分子量在1000Da以下的有机小分子测定粒子束接口(Particle Beam，PB) Sichuan University电喷雾接口(Electrospary，ES) 带有样品的色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出，生成带电液滴，经干燥气除去溶剂后，带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器电喷雾接口主要适用于微柱液相色谱可分析分子量高达几十万道尔顿（Da）的物质 Sichuan University液质常用离子源 使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束。

n电子轰击电离源(elechon impact ionzation source，EI)；n化学电离源(chemical ionization source，CI)n快原子轰击电离源(fast atom bombardment source，FAB)n热喷雾接口(Thermospray interface，TSI)n电喷雾接口(electrospray interface，ESI) 后二者既可作接口也可作为离子源 Sichuan University常用质量分析器 利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离  Sichuan University单聚焦质量分析器原理 Sichuan University四级杆质量分析器原理四级杆质量分析器重现性好，技术较成熟，目前的质谱图库中的图均是用四级杆做的，查找图谱较方便  Sichuan University离子阱质量分析器原理 Sichuan University飞行时间分析器（TOF） 具有相同动能、不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。

如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分析 Sichuan University三、从色谱图的异常推测故障 Sichuan University现象判 断故障排除前前沿沿峰峰柱性能下降柱性能下降更换色谱柱更换色谱柱保护柱失效保护柱失效换柱芯换柱芯进样量太大或样进样量太大或样品浓度太高品浓度太高降低进样量或稀释样降低进样量或稀释样液液 Sichuan University现象判断故障排除峰峰拖拖尾尾柱性能下降柱性能下降更换色谱柱更换色谱柱保护柱失效保护柱失效换柱芯换柱芯色谱柱或保护柱色谱柱或保护柱被污染被污染清洗色谱柱，更换保清洗色谱柱，更换保护柱芯护柱芯色谱柱选择不当色谱柱选择不当选择适宜色谱柱选择适宜色谱柱流动相选择不当流动相选择不当选择适宜流动相选择适宜流动相 Sichuan University现 象判 断故障排除峰变宽柱性能下降更换色谱柱保护柱失效更换柱芯色谱柱或保护柱被污染清洗柱和更换保护柱芯色谱柱选择不当选择适宜色谱柱流动相选择不当选择适宜流动相流动相流速太低增大流速系统未达平衡使系统到达平衡环境温度变化使用柱温箱漏液检查原因并维修 Sichuan University现象判断故障排除峰分叉柱性能下降更换色谱柱保护柱失效换柱芯色谱柱或保护柱被污染清洗柱或保护柱，必要时更换进样量太大或样品浓度太高降低进样量或降低样品浓度样品溶剂与流动相互溶性差改变溶剂或采用流动相溶解样品 Sichuan University现象判断故障排除无峰检测器波长设置错误设置正确的检测波长样品分解重新制样样液未进入色谱柱 检查原因并维修工作站故障检查原因并维修 Sichuan University现象判断故障排除全为负峰连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测器信号极性相反改变极性设置少量负峰离子对分离体系对峰的影响在流动相中溶解样品使用的流动相吸收高使用流动相稀释样品有空气进入清除气泡 Sichuan University 现象判断故障排除鬼峰样品降解或混入杂质用标准品对照，更换样品前一次进样的洗脱物延长或梯度洗脱、提高流速、用强溶剂冲洗注射器和进样口污染清洗注射器和进样口流动相被污染清洗贮液瓶、溶剂入口过滤器、使用HPLC级试剂柱和预柱污染清洗柱或更换预柱柱芯检测器污染清洗检测器管路污染冲洗 Sichuan University现象判断故障排除保留时间不重现系统不稳定应有足够时间平衡室温波动大使用柱温箱柱被污染冲洗柱或更换柱系统泄漏检查并进行维修溶剂配比不合适调节溶剂配比进样量太大或样品浓度太高减小进样量 Sichuan University现象判断故障排除基线漂移系统不稳应有足够时间使系统平衡室温不稳使用柱温箱流动相污染或分解清洗溶剂贮液瓶、清洗溶剂入口过滤器、使用HPLC级试剂流动相脱气不充分脱气重新平衡系统 Sichuan University现象判断故障排除基线漂移流动相配比不当或流速变化更改配比或流速柱被污染冲洗柱或更换柱色谱柱固定相流失用一段连接管路代替色谱柱通流动相检测基线检测池被污染或进入了空气用强极性的溶剂冲洗流通池 Sichuan University现象判断故障排除基线漂移测定波长错误使用分光光度计说明背景吸收，如背景值高，说明流动相含有紫外吸收化合物导致基线漂移。

使用的流动相应在紫外截止波长以外，或更换溶剂系统泄漏检查并进行维修样品中有强保留的物质用强溶剂清洗色谱柱 Sichuan University现象判断故障排除规则基线噪音流动相、检测器或泵内有气泡流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内空气室温不稳使用柱温箱流动相回收使用不使用回收流动相流动相混合不完全使流动相混合均匀或使用低黏度溶剂泵入口管路松或阻塞检查泵入口管路在同一水平上有其他设备关掉仪器，检查干扰是否来自于外部 Sichuan University现象判断故障排除规则基线噪音泵振动在系统中假如脉冲阻尼器泵入口管路松或阻塞 检查泵入口管路在同一水平上有其他设备关掉仪器，检查干扰是否来自于外部 Sichuan University四、高效液相色谱法的应用 Sichuan University1.苯甲酸和山梨酸的测定依据：GB/T 5009.29—2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定 方法概要：试样加热除去二氧化碳和乙方法概要：试样加热除去二氧化碳和乙醇，调醇，调pH至中性，过滤后用至中性，过滤后用HPLC测定 Sichuan University苯甲酸山梨酸 Sichuan University色谱条件：色谱条件：n色谱柱色谱柱C18柱，柱，250mm×4.6mm，，10µmn流动相流动相:甲醇：甲醇：0.02mol/L乙酸铵乙酸铵=5:95；；n流速流速: 1ml/min；；n检测波长：检测波长：230nm；；n柱温：柱温：25℃。

 Sichuan University2.水溶性维生素的测定方法概要：保健食品中的方法概要：保健食品中的8种水溶性维生素在稀盐酸种水溶性维生素在稀盐酸溶液中超声波提取，经微孔滤膜过滤后用反相高效溶液中超声波提取，经微孔滤膜过滤后用反相高效液相色谱法测定液相色谱法测定 Sichuan University几种主要的水溶性维生素维生素维生素B1维生素维生素B2（核黄素）（核黄素）维生素维生素B6（盐酸吡哆醇）（盐酸吡哆醇）烟酸烟酸叶酸叶酸 Sichuan University维生素维生素C叶酸叶酸 Sichuan University色谱条件 线线 性性 梯梯 度度 洗洗 脱脱 流 动 相 A为 0.05mol/L PBS（pH6.0），B为甲醇，进样时，线性变化为20min时的A＋B＝50＋50；然后，B为100%，30min时，再还原为A+B＝90＋10流速1ml/min检检测测波波长长切切换换程程序序：0～10min，266nm（VC，VB1，VB6，烟酸和烟酰胺）；10～15min（叶酸），278nm；15~18min（VB12），360nm；18~20min（VB2），266nm。

柱温：室温 Sichuan University8种水溶性维生素的色谱图 Sichuan University3.奶粉中脂溶性维生素的测定参考依据：国家标准GB/T 5413.9-1997方法概要方法概要 样品中脂溶性维生素经皂化过程与脂肪分离，再用石油醚萃取后，用高效液相色谱，紫外检测器定量测定 Sichuan University主要的脂溶性维生素维生素维生素D3维生素维生素A维生素维生素E Sichuan University样品处理方法 取10g样品，置250ml平底烧瓶，加30 ml水对含淀粉样品，须先经淀粉酶水解 于样液中加入没食子酸乙醇液和50% KOH，回流30min，冷却后，转入分液漏斗，用石油醚萃取萃取液用水洗至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和N2下，旋转蒸发至近干(不能蒸干)，用石油醚定容10ml取2ml放入试管A，7ml放入试管B，N2吹干，A中加5ml甲醇，测VitAE，B加1ml正己烷，测VitD Sichuan University维生素A和E的测定条件n仪器条件：色谱柱：25cm×4.6mm，ODS色谱柱。

流动相为甲醇流速为1.0ml/min检测波长：维生素A为325nm；维生素E为290nm  Sichuan University维生素D的测定条件 色谱柱25cm×4.6mm，C18色谱柱流动相为甲醇流速为1ml/min柱温为20℃波长为265nm注射体积为50μL Sichuan University4.蔬菜中12种农药残留测定方方法法概概要要：：将将样样品品捣捣碎碎，，用用乙乙酸酸乙乙酯酯超超声声提提取取，，经经Florisil固固相相萃萃取取柱柱净净化化、、正正己己烷烷－－二二氯氯甲甲烷烷（（1：：1，，v/v））洗洗脱脱、、氮氮气气吹吹干干浓浓缩缩、、甲甲醇醇定定容容后后用用高高效效液液相相色谱柱分离、紫外检测，外标法峰面积定量色谱柱分离、紫外检测，外标法峰面积定量  Sichuan University测定的12种农药 二嗪农、氧化乐果、辛硫磷、甲基对硫磷、稻丰散、氯氟胺氰戊菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、苄氯菊酯、氰戊菊酯、二甲戊乐灵 Sichuan University仪器及条件仪器及条件•色谱柱：ODS C18柱，5μ，250×4.6mm；流动相为乙腈-水；梯度洗脱程序：50％乙腈（v/v）0～10min线性上升至64％乙腈，然后10min～10.01min从64%乙腈变为67％，10.01～35min内乙腈由67％上升至94％；流速，1.2ml/min；柱温，25℃；•紫外检测，波长切换程序：在0～10min波长为200nm，10～13 min为272nm，13～16min为230nm，16～22min为289nm，22～25.8min为238nm，其余时间波长为206nm。

 Sichuan University•样品采集与处理 称取搅碎样品10.0g于锥形瓶中，加入乙酸乙酯和足量无水硫酸钠剧烈振摇除去水分，超声提取，上清液抽滤，残渣重复超声提取一次滤液用旋转蒸发仪（35℃水浴）挥干，用少量二氯甲烷溶解残渣，样液用Florisil固相萃取小柱净化，然后用7ml正己烷－二氯甲烷（1：1，v/v）淋洗，收集流出物35℃水浴弱氮气流下挥干，用0.10ml甲醇溶解残渣15000rpm离心2min后色谱测定 Sichuan University12种农药标准图谱 Sichuan University。