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分子发光分 析 法Molecular Emission Analysis 第五章一、分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系relation between fluorescence and molecular structure 四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence五、仪器结构流程instrument and general process六、荧光分析方法与应用fluorescence analysis and application主 要 内 容一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1、S2； 第一、第二、电子激发三重态 T1、T2；2.激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3外转换 2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。

发生振动弛豫的时间10-12s内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁改变电子自旋，通过自旋轨道耦合进行辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为S1S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9s由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1发光速度很慢：10-4100s光照停止后，可持续一段时间二、激发光谱与荧光(磷光)光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。

激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2) c. 镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然 200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系relation between fluorescence and molecular structure 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；1.荧光寿命和荧光效率荧光寿命（fluorescence life time）：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。

荧光量子产率（ fluorescence quantum yield）：2.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有强的紫外-可见吸收；（2）具有一定的荧光量子产率3.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移苯萘蒽维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm0.110.290.36（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有弱荧光物质荧光加强（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强 给电子取代基如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高; 而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸电子取代基，可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭; 部分取代基对荧光的影响不明显，如R、SO3H、NH3 等四、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。

3. 溶液pH溶液的酸度（pH值）对荧光物质的影响可以分两个方面： （1）对酸碱性物质的影响（掌握） 若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率例如苯胺（2） 对金属离子的影响（了解） 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质例如Ga3+离子与邻-二羟基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光而在pH67的溶液中，则形成12的配合物，不产生荧光4.散射光的干扰瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，光子的运动方向发生改变，其波长与入射光相同散射光：由于光子与溶剂分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射，称为散射光 瑞利光的特点：强度与波长的四次方成反比，即波长越短，瑞利散射光越强瑞利光的消除：因瑞利散射光波长与激发光波长相同，只要选择适当的荧光测定波长或选用滤光片即可消除其影响拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生的同时，光子与物质分子发射功能能量交换，使光子能量发生改变，其波长可能长于入射光，也可能短于入射光。

拉曼光特点：波长较长的拉曼光因其波长与物质的荧光波长相接近, 故对测定的干扰较大拉曼光的消除：由于拉曼光波长随激发光波长的改变而改变, 而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关, 故通过选择适当的激发光波长，就可以将二者区分开320nm448nm350nm448nm激发320nm硫酸奎宁激发350nm硫酸奎宁硫酸奎宁的激发光谱5.溶液荧光的猝灭荧光熄灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光其哪个度降低或荧光强度与浓度偏离线性的现象引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等 熄灭原因：碰撞猝灭；氧的熄灭作用等1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；（2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；（3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态；（4）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自熄灭现象溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；（5）溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭荧光熄灭的原因 概念：利用荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和熄灭剂的浓度呈线性关系这一性质建立的荧光分析法，称为荧光熄灭法。

特点：荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏、更有选择性应用示例：铝-桑色素配合物的荧光强度因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭，利用这种性质可测定样品中微量氟离子的含量，这时溶液的荧光强度和氟离子浓度成反比 荧光熄灭法五、仪器结构流程instrument and general process 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管仪器光路图仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；六、荧光分析方法与应用fluorescence analysis and application1. 特点（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？ 检测下限：0.10.0001g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少 缺点：应用范围小2.定量依据与方法(1)定量依据荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2）定量方法标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；3.荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。

铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析 本章小结1.掌握分子荧光及磷光产生的条件及原理；熟悉分子从激发态释放能量返回基态的主要方式 2. 掌握两种特征荧光光谱的概念及三个特征3. 掌握分子结构与荧光的关系；熟悉荧光寿命和荧光效率的概念，熟悉影响荧光强度的外部因素4. 熟悉荧光强度与荧光物质浓度的关系及应用条件，了 解定量分析的两个常用方法5. 对比紫外-可见分光光度法的仪器组成，熟悉荧光分析仪的主要部件和仪器特点。