酶工程 教学课件 ppt 作者 梁传伟 张苏勤 主编 胡本高 主审第四章.ppt

酶工程,第四章 酶的分离纯化,第一节 细胞破碎,一、机械破碎法 利用机械力的搅拌，剪切、研碎细胞常用的有高速组织捣碎机(Waring blender)、高压匀浆泵(国外称Manton-Gaulin)、玻璃或Teflon研棒勾浆器(国外称Potter-E1vehem homogeniver)、高速球磨机或直接用研体研磨等动物组织的细胞器不甚坚固、极易匀浆，一般可将组织剪切成小块，再用匀浆器或高速组织捣碎器将其匀质化匀浆器一次处理容量约50mL，高速组织捣碎器容量可达500—1000mL左右高压匀浆泵非常适合于细菌、真菌(如酵母)的破碎，且处理容量大，一次可处理几升悬浮液，一般循环2—3次，足以达到破碎要求第一节 细胞破碎,二、超声波法 超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段经过足够时间的超声波处理，细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎若在细胞悬浮液中加入玻璃珠，时间可更短些，一般线粒体经过125W超声处理5min可全部崩解超声波破碎一次处理的量较大，超声效果以探头式超声器较水浴式超声器更佳超声处理的主要问题是超声空间局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。

第一节 细胞破碎,三、渗透压法 渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁 四、化学破碎法 化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法第一节 细胞破碎,1.有机溶剂处理 常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等 有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外 例如，将细胞悬浮在10倍体积的预冷至-20℃的丙酮之中，搅拌均匀，待自然沉降后弃上清液，抽滤得细胞，再用2.5倍体积的-20℃丙酮洗涤，抽干后，把得到的细胞立即放入真空干燥器中，除去残余的丙酮，得到细胞干粉，可长期保存，使用时再用水或缓冲液把胞内酶提取出来常用的大肠杆菌谷氨酸脱羧酶就是用这种方法获得的第一节 细胞破碎,2．表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性 表面活性剂有离于型和非离子型之分，对细胞破碎效果而言，离子型表面活性剂较有效，但由于离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，引起酶变性失活。

所以，在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂而采用非离子型的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂例如，用特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞，从而提取胆甾醇氧化酶，用胆酸盐处理细胞，提取一种膜结合的葡聚糖酶等处理完后，可采用凝胶层析等方法，将表面活性剂除去，以免影响酶的进一步分离纯化 表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用第一节 细胞破碎,五、生物破碎法 在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎 1.外加酶处理 根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂 革兰氏阳性菌主要依赖其细胞壁中的肽多糖维持其细胞结和形状溶菌酶能专一地作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键所溶菌酶常用于革兰氏阳性菌的细胞破碎对于革兰氏阴性菌，则在加入溶菌酶的同时，还要加入EDTA，才能达到细胞破碎的效果酵母细胞壁的主要成分是β-l，3-葡聚糖，酵母细胞的破碎需外加一定量的β-葡聚糖酶而霉菌细胞壁含有几丁质，故此，几丁质酶可用于霉菌的细胞破碎纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用，作用于植物细胞的细胞壁，而使植物细胞破碎。

由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高，而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质，故此，外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产第一节 细胞破碎,2.自溶法 将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释出的方法称为自溶法 自溶法效果的好环取决于自溶条件主要有温度、pH值、离子强度等自溶时间一般较长，不易控制，为防止其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂 此外，可以通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离幅射等方法，使细胞自溶第二节 酶的提取,酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程也称为酶的抽提 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件第二节 酶的提取,一、酶提取的主要方法 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。

第二节 酶的提取,1.盐溶液提取 大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～0.5mol/L的范围内例如，用固体发酵生产的麸曲中的α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好第二节 酶的提取,2．酸溶液提取 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取例如从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液进行提取 3.碱溶液提取 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取例如，细菌L-天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH11～12.5的碱溶液中，振荡20min，即达到显著的提取效果第二节 酶的提取,4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。

常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取 二、酶提取过程的注意事项 在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，必须注意如下几点：,第二节 酶的提取,1.温度 为了防止酶的变性失活，提取时温度不宜高特别是采用有机溶剂提取时，温度应控制在0～10℃然而有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸梅、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些温度下提取因为在不影响酶的稳定性的条件下，适当提高提取温度，可以提高酶的扩散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提取和进一步的分离纯化 2.pH值 溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著的影响为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点但是除了酸溶液提取或碱溶液提取者以外，提取时溶液的pH值不宜过高或过低，以防止酶的变性失活第二节 酶的提取,3.提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率但是过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利故提取液的用量一般为含酶原料体积的3～5倍可一次提取，也可分几次提取，若辅以缓侵搅拌，则可提高提取率。

4.添加保护剂 在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某些抗氧化剂等保护剂第三节 酶的提纯,酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用表4—1列出了最常用的纯化方法 一、酶提纯的主要方法,第三节 酶的提纯,表4—1酶提纯的主要方法,第三节 酶的提纯,二、调整酶溶解度的方法 1.改变离子强度 蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，所以能保持溶解状态当加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，溶解度增加，这种现象称为盐溶但当盐浓度继续加大时，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀出来，这就是盐析大部分酶在细胞中呈溶解蛋白的形式存在(达细胞总量40％)，在中性pH和离子强度为0.15～0.2mol/L的生理条件下极易溶解，因此得到粗酶抽提液后，改变这些条件就可使酶沉淀析出第三节 酶的提纯,盐析时常用的盐有钠、钾、铵的硫酸、磷酸及柠檬酸盐硫酸铵因具有高溶解度，对酶作用温和且价廉等特点而最为常用。

由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不同，故可采用分级沉淀法分离酶如兔肝超氧化物歧化酶(SOD)分离时，在粗抽提液中加入固体硫酸铵至40％饱和度，将部分杂蛋白沉淀，离心去除在上清液中继续加固体硫酸铵至75％饱和度，将SOD沉淀下来，离心得到沉淀，即为第一步纯化的兔肝SOD第三节 酶的提纯,一种最有用的硫酸铵分级改进法即所谓反抽提法(Back—Extraction)以E.coli RNA聚合酶的硫酸按分级沉淀为例：此酶通常在42％一50％硫酸铵饱和度时沉淀用通常的分级沉淀方法是加硫酸铵至33％饱和度，弃去沉淀在上清液中再加入硫酸铵至50％饱和度，析出RNA聚合酶分离出沉淀，溶解于含有适当离子强度的缓冲液中而反抽提法则是将该沉淀再悬浮于42％饱和度的硫酸铵溶液，这时沉淀中原来带有的某些杂蛋白又溶解了，而RNA聚合酶仍留在沉淀中，因而得到分离换言之，反抽提法的原理就是将包括要分离的酶在内的多种蛋白质一起先沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来油提沉淀物这种方法的优点在于许多蛋白质从溶液中沉淀析出十分容易，是非特异性的，但反过来，沉淀在溶液中溶解却有相当高的特异性第三节 酶的提纯,硫酸铵反抽提法在提取易失活的酶时更有其优越注。

例如，与Cu、Zn—SOD相比，肝脏Mn—SOD很不稳定，容易失活采用一般硫酸铵分级沉淀法纯化时，得率较低若用反抽提法，将肝脏组织在85％饱和度的硫酸铵溶液中勾浆破碎，离心得到沉淀，再用65％饱和度硫酸铵溶液洗涤，弃去上清液，再以35％饱和度的硫酸铵溶液抽提，Mn—SOD得率较高此外，反抽提法还用于多酶体系的纯化过程使用这一方法酶活得率一般较高，可能是因为酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故第三节 酶的提纯,具体进行硫酸铵盐析操作时还应注意：一是溶液的pH位硫酸铵略呈酸性，大量加入会改变溶液pH值，一般可用稀浓度氨水来校正；二是硫酸铵应在搅拌中缓慢加入，避免溶液中硫酸铵局部浓度过高，当然搅拌也需温和，避免产生大量气泡 硫酸铵分级沉淀法通常可去除抽提液中75％的杂蛋白，并可大大浓缩酶液，浓缩程度取决于用多少溶液溶解沉淀的酶蛋白酶液体积越小，后续上柱分离就越容易第三节 酶的提纯,2. 改变pH或温度 酶在等电点时，溶解度最小将溶液pH调到酶的等电点，可使酶沉淀析出但在末纯化前等电点一般是未知的，需慢慢摸索，对某一特定的酶而言，pH变化范围不易过大，以免酶失活 利用温度的变化来改变酶溶解度的方法同pH变化一样，比较难以控制，但如果纯化一些对热不敏感的酶，这一方法有着不可比拟的优点。

加在纯化Cu，Zn—SOD时，将溶液在70℃加热10min，很多杂蛋白变性被除去，Cu，Zn-SOD仍稳定存在于溶液中使用这一方法应注意酶溶液从一个温度加热到另一温度的时间要短，并应用壁薄，具有大表面积的不锈钢容器进行加热第三节 酶的提纯,3. 改变介电常数 在溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可显著降低溶液的介电常数，从而使酶分子相互之。