药用植物DNA标记辅助育种（一）：三七抗病品种选育研究.doc

药用植物DNA标记辅助育种（一）：三七抗病品种选育研究［摘要］药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子 杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等 表型关联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育该研究采用DNA标记 辅助育种结合系统选育的技术，选育首个三七抗病新品种“苗乡抗七1号” 结果表明，基于RADSeq技术检测出抗病品种包含12个特异S7P位点，经 验证record_519688位点与三七抗根腐病相关，包含此位点的基因片段可 作为抗病品种的遗传标记辅助三七系统选育；与常规栽培种相比，抗病品 种种苗根腐病及锈腐病的发病率分别下降836%, 718%；二年牛及三年牛三 七根腐病的发病率分别下降436%, 629%O此外，依据与抗病关联的SNP筛 选三七潜在的抗病群体，该模式扩大目标群体并提高选育效率药用植物 DNA标记辅助育种将加快药用植物新品种选育及推广的进程，保障中药材 产业健康发展［关键词］药用植物；DNA标记辅助育种；三七；连作障碍；抗病 品种；简化基因组测序技术；单核甘酸多态性药用植物传统育种主要依赖于植物的表型选择，一个优良品种的培育 往往需要花费几年甚至十几年的时间，如何提高育种效率，是育种的关键。

基因型与环境间互作等多重因素会影响表型选择效率，现代分子牛物技术可加快药用植物育种进程，而且缩短育种周期，其中药用植物DNA标记辅 助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测 序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型相联的DNA片段作为标记，辅 助新品种的选育，该技术可应用于遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标 记定位、种质资源遗传多样性、分子标记辅助选择等方面随着测序成本 的降低，已经陆续在中草药开展了转录组、全基因组测序，这些序列信息 提供了大量的SSR和SNP等分子标记，有利于高密度遗传图谱和物理图谱 的构建，高密度图谱加速了分子标记与优良性状之间的连锁研究，为发掘 植物抗逆及参与有效成分合成途径的新基因提供了许多线索和启示，提高 了选育的效率陈士林等首次提出“Ilerbgenomics”的概念，该学科涉及 中草药结构基因组、功能基因组、基因组辅助育种、中草药蛋白质组学、 中草药宏基因等内容，并阐明本草基因组学将加速药用植物优良品种的选 育并促进绿色中药农业的科学化和规模化发展［12］本文以三七Panax notoginseng (Burk) FH Chen为例，介绍了药用 植物依据DNA多态性为基础，利用高通量测序技术筛选与抗病相关联的SNP 标记，辅助三七抗病新品种的选育。

三七是五加科人参属植物，其性温、 味甘、微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的功能，是片仔廣、云南白药、复 方三七口服液等常见中药制剂的主要原料之一［3］三七在心脑血管方面 的独特疗效越来越被人们所认可，其需求量逐年增加为满足H益增长的 需求，三七已经开展了系统的栽培技术研究，形成了较为规范的GAP技术 体系［4］然而三七为典型的生态脆弱型阴生植物，其分布区域较窄，连 作障碍等问题严重［56］三七的人工栽培过程中病虫害比较严重，例如根 结线虫病害显著抑制了三七块根的生长，抑制率高达30%以上［7］；三七种植导致根际土壤微牛物多样性及组成的变化，随着其种植年限增加根腐病 致病菌Fusarum oxysporum的半度显著增加［8］在病害防治过程中，高 毒农药的投入破坏了三七田间生态系统，并造成三七农残及重金属超标 而三七不同栽培品种的抗病性存在显著性差异，选育抗病性品种可获得性 状优良、抗逆性强的三七群体植株，有效的减少农药的使用量［911］ o抗 病新甜种的选育是保障三七产业可持续发展的策略之一系统选育是三七遗传改良的方式之一，也是三七育种的重要手段0 玉琴等对三七植株性状差异进行比较，结果表明三七植株的茎、块根、休 眠芽、花序、叶、果实存在明显变异，为三七育种工作提供了依据［12］ o 通过对三七不同变异类型中皂昔含量的比较分析，确定将紫根、复叶柄平 展型、长形根、宽叶4种类型作为三七甜种选育的目标［13］。

然而系统选 育育种周期长，受环境影响较大，在短时间内选择优良性状难度极大采 用DNA标记辅助三七新品种的选育，该方法不仅准确性高，而且缩短育种 周期本研究利用高通量测序技术检测抗病群体中的SNP位点，结合PCR 技术筛选与三七抗病关联的DNA片段，以此基因片段作为标记辅助系统选 育，并利用该关联基因片段筛选潜在的抗病群体该模式可加快新品种选 育及推广的进程，为中药材可持续发展提供思路及策略1材料与方法11三七DNA标记辅助新品种选育流程从文山周边收集抗病单株并播种于云南文山三七科技示范园的试验田，该试验田为三七连作5年病圃采集病中存活三七单株的种子，建立抗病群体；采用简化基因组测序技术(restrietionsite associated dna sequencing, RADSeq) 结合 PCR 技术筛选抗病群体的关联SNP位点，辅助三七新品种的系统选育；通过淘汰 非目标性状，分离和纯化抗病群体，选育三七抗病新品种，三七DNA标记 辅助选育流程见图lo12SNP位点分析采用高通量测序技术筛选抗病植株特异的SNP位点， 阐述其特异性分别采集30株抗病及感根腐病三七植株，釆用HiSeq PE150 测序，有效数据用于分析寻找SNP标记。

测序流程为：利用多种限制性内 切酶对该物种DNA分别进行酶切，根据酶切实验的结果选择合适的酶进行 后续实验；质检合格的DNA样品，采用RAD建库方式构建长度范围在300〜 500 bp的pairend文库；Illumina IliSeq PE150测序，有效数据用于分 析寻找海量SNP标记首先，对每个样甜中的RADtag进行比对归类，按照每类tag的深度 信息由大到小进行排序，得到每个个体的RADtag频数表［14］ o每个样品 的RADtag内部进行比对得到样品内部的杂合位点信息不同样品Z间的 RADtag进行互相的比对，寻找个体之间单碱基差异信息［15］综合考虑每 个个体RADtag的频数表信息和比对信息，过滤掉可能来自重复区域的结 果，从而得到高可信度的群体S7P标记基因分型结果［16］其中性状关联 的算法参照 GLM (General Linear Model)模型［17］ 13SNP 位点开发基于RADSeq技术获得的SNP位点，设计引物筛选与三七抗病性关联 的SNP位点在人工病圃中分别采集60株三七抗病株及感根腐病植株， 采用植物基因组提取试剂盒(天根，中国)提取三七叶片总DNA, DNA浓 度及质量经检验后，于-20 C备用。

随机挑选SNP位点进行开发，以 record 519688位点设计抗病及对照群体的通用引物，引物序列为F1： 5’ TCATTATTATTATCCTC3 , Rl： 5’ GAGCTTAACTAGCCCAG3针对上述 SNP 位点设计抗病群体的特异引物，为提高SNP分析的特异性，在特异引物的 3 7端区域加入1个人工错配碱基，序列信息为Fkl： 5’ CATTATTATTATCCTCTTC3 7 ,其中反向引物为 R10 采用 Pyrobest DNA Polymerase （货号DR005A,日本TaKaRa公司）对供试DNA进行PCR扩增， 反应体系参照王瑞等［18］报道PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，产物 送美吉公司进行测序将产物的序列信息与RADSeq获得的序列进行比对, 确定与抗病相关联的SNP位点14种苗等级分析将抗病群体的种子收集并播种后，分析种苗等级（n二186）,其分类等级依据见表1,同时以常规栽培品种（n二186）为对照, 分析抗病甜种的种苗质量表1三七种苗分级标准Table IThe classifiedtion standard of notoginseng seedlings 分级单株重/g外观形态一级225休眠芽肥壮，根系生长良好，无病 虫感染和机械损伤二级125—25休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染 和机械损伤三级075〜125休眠芽生长一般，根系生长一般，无病虫感染 和机械损伤15病害调查随机取30株种苗，分析其病害类型及发病情况，以常规 栽培种为对照，3次重复；调查二年生及三年生三七病害类型及发病率 （n二60）,并以常规栽培种为对照，3次重复。

16利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体采用与抗病性关联 S7P位点（rocord_519688）的引物筛选留种基地的三七单株，保留含目标 位点的植株栽种到人工病圃中进行系统选育，该模式扩大三七目标株系的 繁育群体，提高育种效率并加快其新品种推广的进程17数据分析采用SPSS 160软件，在005水平进行显著性方差分析2结果21抗病植株的SNP位点开发结合SNP数据和表型数据，使用tassel v52进行性状关联分析，与感病群体相比，抗病群体具有12个差异的SNP 位点（极显著L0D>3）・833%）,而感病株无条带，见图2B测序产物序列与RADSeq序列结果 一致，感病株与抗病株的变异位点，见图2C结果表明，本试验中该SNP 位点与三七抗病性相关，可作为三七抗病品种的DNA标记依据该位点对 抗病群体后代进行选择，冃标株为667%,淘汰非冃标株辅助系统选育A通用引物PCR产物；B特异引物PCR产物；C感病株与抗病株的PCR 产物序列信息；1〜10及a〜k抗病品种；11〜12感病品种;MDNA Marker； CK感病株；RC抗病株22三七抗病品种的种苗等级基于三七种苗质量及外部形态，制定了种 苗的等级指标见图3A。

休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损 伤，单株质量大于等于25 g的种苗为一级，单株质量125~25 g的种苗 为二级；休眠芽及根系生长一般，无病虫感染和机械损伤，单株质量075〜 125 g的种苗为三级；单株质量小于075 断轮置纭3 9嬖耘嘀钟月亏共刀分值囊患吨置绶直鹤?400%, 389%；二级种苗分别为156%, 267%,三级 种苗分别为111%, 167%,级下种苗分别为333%, 178%见图3B常规栽培 种及抗病品种的一级和二级种苗总量分别为556%, 656%23三七抗病品种的病害类型及发病率调查发现，该试验区内常规栽培种及抗病品种种苗的主要病害类型为根腐病及锈腐病，见图4常规栽培 种及抗病品种种苗根腐病的发病率分别为67%, 11%,而锈腐病发病率分别 为156%, 44%,抗病品种的根腐病及锈腐病发病率分别下降836%, 718% 结果表明，抗病品种种苗对根腐病及锈腐病表现显著的抗性调查结果表明，二年及三年生三七主耍病害类型为根腐病，见图5A,Bo常规栽培种及抗病甜种的二年生三七根腐病发病率分别为34%, 19%,三年生三七该病的发病率 为114%, 42%,见图5C。

与对照相比，二年及三年生三七抗病品种的根腐 病发病率显著下降了 436%, 629%O结果表明，二年及三年生三七抗病品种 对根腐病表现出显著的抗病性24利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体在3个留种基地进行 5 000份单株留种，利用抗病品种的SNP位点进行筛选，见图6留种基 地分别为平远镇莲花塘、砚山县郊址村及文山县平坝镇随机抽取每个基 地100份单株，釆用通用引物（F1,R1）均检测出清晰的目标条带（n二300）,特异引物（Fkl, R1）检测该300份三七样品的56份样品包含清晰的冃标 条带结果表明，随机检测的自然群体中，包含目标位点的单株为187%后续试验中将目标株通过人工病进行系统选育，加快抗病品种的扩繁4讨论本研究利用DNA标记辅助系统选育技术获得首个三七抗病新品种，选 育纯化后的抗病品种表现一致性、稳定性及特。