细胞瞬时转染 稳定转染.docx

细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性 及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转 染和稳定转染细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程质粒、DNA、RNA将这些外源 基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的 生长复制因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直至I」外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因 素消失为止判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转 染两天后即能被检测到稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生 长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经 过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后 代瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。

瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转 染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成相对于瞬时转染，稳定转染表达适用 于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高 目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人 们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本 细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含 抗性的正常培养基针对每孔细胞，用50-100ul无血清培养基稀释0.8-1.6ug的质粒，并混匀针对每孔细胞，用50-100ul无血清培养基稀释4ul左右的转染试剂，混匀室温防止5min将第二第三步的溶液混匀室温防止20-30min用PBS冲洗细胞，在用无血清培养基冲洗细胞，在加入0.5ml的无血清培养基将四步骤得到的混合物加入到每孔中，轻摇混匀后放 入37°C, 5%的二氧化碳培养箱中培养5-6h将无血清培养基换为血清培养基(10%胎牛血清)孵 育24-96h后检测结果。

稳定表达，在转染24h后传 代至新鲜培养液中，48h后加入抗性，稳定表达需要 数周时间哺乳动物细胞蛋白表达简洁流程图影响转染效率因素1. 转染试剂瞬时转染和稳定转染可以选择不同的转染试剂，转染试剂的选择又可以根据已经发表的文献已经有很多 细胞株被成功转染，通过文献资料可以参考最适的转染试剂，当然也要根据不同的实验需求选择此外， 不同的转染方法也要选择不同的试剂，一般要求是转染试剂要低毒，高效，廉价易得2. 转染方法转染方法分为两类：瞬时转染和稳定转染转染方法的选择对转染结果影响也很大，根据细胞的性质及不 同的操作手法，摸索最佳的转染条件瞬时转染和稳定转染都需要优化DNA与转染试剂比例，细胞培养 及检测时间一些传统的转染技术，如磷酸钙法，电穿孔法，脂质体转染法都各有利弊，关于各种转染方 法的比较和原理，可参见细胞培养方法的比较3. 细胞状态一般传代数小于50代以下的细胞即能保证基因型不变瞬时转染最合适的细胞是达到对数生长期的细胞， 此时细胞生长旺盛，最容易被转染同一种系的细胞株，在不同实验室不同培养条件下，其生物学性状都 会产生不同改变，从而导致其转染特性也发生变化因此，针对这种转染效率降低的情况，应转用新鲜培 养的细胞转染达到好的结果。

4. 载体构建基因产物对细胞不能有毒害作用，瞬时转染难以进行转染载体的构建选择可调控，强度合适的启动子很 重要，可以做空载体或相同载体的其他基因为对照排除毒性对细胞的影响病毒载体对特定宿主细胞感染 效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的 宿主细胞5. 其他要求(1)细胞培养基培养基是瞬时转染的最基本要素不同细胞选择不同的培养基，血清和其他添加物使用的转染试剂要参 考其说明书培养物一定要避免细菌，支原体真菌的污染2 ）血清血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的成分不明确添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别血 清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响细胞转染效率，不同批次购买的血清质量也会存在差别 对于传统的转染方法要求在无血清培养基条件下转染，血清被认为会降低瞬时转染的效率针对现有人们 常用的的转染试剂来说，血清的存在已不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率在转染过程中完 全可以使用血清，针对RNA转染，消除血清中潜在的核糖核酸酶污染要格外关注且血清比较珍贵，胎 牛血清，马或牛血清都常被用到，价格也不尽相同，根据自身选择3 ）细胞密度细胞密度对转染效率也有一定影响，一般转染时贴壁细胞密度为50-90%，具体要根据选用的转染试剂的 说明书。

不同的转染试剂最适的细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异 例如阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而要更高的细胞铺板密度或更多的悬浮细胞数，尽量在细胞最适的 生理状态下转染，以求最佳的转染效果4）DNA质量针对一般常用的转染技术都是基于电荷吸引的原理转染的，如果DNA的纯度不高，存在其他杂质，如盐离 子等都会影响转染复合物的形成针对市面上现有的超纯质粒抽提的试剂盒，能达到非常高的纯度效果， 从而可以避免DNA纯度的影响更多有关蛋白表达和分子生物学方面的文章请见：德泰生物资料专区。