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第七章 组织工程学概述组织工程的概念组织工程的概念组织工程三要素组织工程三要素组织工程相关生物材料组织工程相关生物材料组织工程研究方法组织工程研究方法组织工程化皮肤及骨的应用及展望组织工程化皮肤及骨的应用及展望1. 组织工程的概念组织工程的概念Robert Langer教授和麻省理工大学教授和麻省理工大学医学院的临床医生医学院的临床医生Joseph P Vcanti正式提出组织工程的概念正式提出组织工程的概念1987年，美国国家科学院基金会在加年，美国国家科学院基金会在加利福尼亚的利福尼亚的Lake Tahoe举行的专家举行的专家讨论会上明确了组织工程的定义讨论会上明确了组织工程的定义1984年华人学者冯元桢首次提出年华人学者冯元桢首次提出组织工程的概念组织工程的概念一）一）.提提出出二）二）.组织工程学定义：组织工程学定义： 运用工程科学和生命科学的原理及方运用工程科学和生命科学的原理及方法，从根本上认识正常和病理的哺乳动法，从根本上认识正常和病理的哺乳动物组织和结构功能的关系，并研究生物物组织和结构功能的关系，并研究生物学的替代物，以恢复、维持和改进组织学的替代物，以恢复、维持和改进组织的生物替代物的一门科学。

的生物替代物的一门科学三）. 组织工程基本原理•应用工程学、生命科学和材料学的原理与方法，应用工程学、生命科学和材料学的原理与方法，将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上，细胞在支架上增殖、分化，构建生多孔支架上，细胞在支架上增殖、分化，构建生物替代物，然后将之移植到组织病损部位，达到物替代物，然后将之移植到组织病损部位，达到修复、维持或改善损伤组织的功能修复、维持或改善损伤组织的功能•科学意义：不仅在于为解除病人痛苦提供了一种科学意义：不仅在于为解除病人痛苦提供了一种新的治疗方法，更重要的是提出了新的治疗方法，更重要的是提出了复制复制“组织组织”、、“器官器官”的新思想，它标志着的新思想，它标志着“生物科技人体生物科技人体时时代代”的到来，是的到来，是“再生医学再生医学的新时代的新时代”，是，是“一一场深远的医学革命场深远的医学革命•核心：构件由细胞和生物材料构成的三维复合体核心：构件由细胞和生物材料构成的三维复合体•三要素：三要素： 种子细胞种子细胞 生长因子生长因子 支架材料支架材料2.组织工程的三要素组织工程的三要素组织工程的三要素组织工程的三要素假体支架种子细胞生长因子•种子细胞——干细胞•支架：细胞立脚点的支撑体。

人工细胞外基质称为细胞增殖和分化的“立脚点”，例如，立体海绵状骨胶原•生长因子：让细胞增殖和分化的因子要确保必须的细胞立脚点，必须让细胞的数量大幅增加控制细胞分裂的是一种被称为“细胞增殖因子”的蛋白质一）.种子细胞 种子细胞是组织工程研究的基础，也是制约组种子细胞是组织工程研究的基础，也是制约组织工程发展的瓶颈织工程发展的瓶颈 主要原因：主要原因： 许多组织细胞（如软骨细胞、内皮细胞）的供体来源许多组织细胞（如软骨细胞、内皮细胞）的供体来源和扩增能力均非常有限，无法通过取少量组织体外扩增细和扩增能力均非常有限，无法通过取少量组织体外扩增细胞来构建大块组织，很难实现胞来构建大块组织，很难实现““小损伤修复大缺损小损伤修复大缺损””的组的组织工程基本设想织工程基本设想 干细胞干细胞来源广，增殖力强，又能定向诱导分化为多种来源广，增殖力强，又能定向诱导分化为多种目的细胞并形成相应组织，因此，应用干细胞能够实现目的细胞并形成相应组织，因此，应用干细胞能够实现““小损伤修复大缺损小损伤修复大缺损””的基本设想，这为解决组织工程种子的基本设想，这为解决组织工程种子细胞问题提供了良好机遇。

细胞问题提供了良好机遇二.）支架1）定义 能与组织活体细胞结合并能植入生物体的三维结构体2）支架材料最基本的特征l与活体细胞直接结合：羟基磷灰石（HAP）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）网、尼龙网l与生物系统结合：植入生物体的组织工程化软骨、骨、肌腱、牙、肺、肝、肾等组织与机体的结合l具备细胞相容性和组织相容性（统称生物相容性）3）支架材料Ø材料：钙磷材料、多聚物（合成的和自然的）Ø要求：微孔结构、化学组成、可降解、力学性能Ø作用：•在结构上加强缺损部位的强度；•阻碍周围组织长入；•作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖的支架；•利用与细胞整合素以及受体的相互作用，作为一种可溶的细胞功能调节因子；•作为细胞、生长因子和基因的生物载体三）.生长因子1）定义）定义 在细胞间传递信息并对细胞生长具有调节功能的一些在细胞间传递信息并对细胞生长具有调节功能的一些多肽类物质，它可以促进或者抑制细胞的增殖、分化、迁多肽类物质，它可以促进或者抑制细胞的增殖、分化、迁移和基因的表达移和基因的表达2）分类）分类 按受体的结构分类，成纤细胞生长因子（按受体的结构分类，成纤细胞生长因子（FGF）、表）、表皮细胞生长因子（皮细胞生长因子（EGF）和肝细胞生长因子（）和肝细胞生长因子（HGF）等）等3）将生长因子用于组织工程技术中时，有两种不同）将生长因子用于组织工程技术中时，有两种不同的方式：的方式：•生长因子直接复合到支架上或者在支架构建之后再与其符生长因子直接复合到支架上或者在支架构建之后再与其符合；合；•在支架上同时移植能分泌生长因子的细胞。

在支架上同时移植能分泌生长因子的细胞3.组织工程研究方法1）研究的核心内容：研究的核心内容：合适的种子细胞来源、可供细胞粘合适的种子细胞来源、可供细胞粘附生长的生物支架附生长的生物支架(或细胞外基质或细胞外基质)、用于促进组织再生长、用于促进组织再生长因子和组织的相容性等问题因子和组织的相容性等问题2）利用组织工程方法生成活体替代组织或器官常可使用细胞分离细胞分离体外培养扩增体外培养扩增种植到多孔支架种植到多孔支架植入缺损部位植入缺损部位生物活性肽生物活性肽多孔支架多孔支架策略策略2策略策略1微结构微结构策略策略3生物过程生物过程PLA支架（支架（灰色）灰色）+间充质干细胞（间充质干细胞（绿色）绿色）激光共聚焦显微镜照片激光共聚焦显微镜照片培养培养6天天 培养培养10天天4.组织工程相关生物材料组织工程相关生物材料组织工程相关的生物材料主要有两种：Ø天然的材料：胶原Ø合成聚合物：开始于20世纪80年代中期优点：1）生物相容性 2）可复制性3）可生物降解4）通过与多聚物结构一体化来连续地输送营养和激素 各种各各种各样的可生物降解材料已用作的可生物降解材料已用作组织支架，支架，包括陶瓷和多聚物。

包括陶瓷和多聚物Ø 陶瓷主要用于骨陶瓷主要用于骨组织工程，再次运用了工程，再次运用了羟基磷基磷灰石多孔配方以承灰石多孔配方以承载来源于骨膜或骨髓的骨祖来源于骨膜或骨髓的骨祖细胞Ø 多聚物支架的典型形式多聚物支架的典型形式：：纤维网、多孔海网、多孔海绵或泡或泡沫、或是水合凝胶在沫、或是水合凝胶在纤维网和泡沫中更常使用的网和泡沫中更常使用的多聚物包括多聚物包括线形聚形聚酯，例如，聚乙酸（，例如，聚乙酸（PGA）、聚）、聚乳酸（乳酸（PLA）和聚已内）和聚已内酯（（PCL）；聚乙二醇）；聚乙二醇（（PEG）以及天然聚合物如胶原和透明）以及天然聚合物如胶原和透明质酸5.组织工程化皮肤及骨的应用及展望目前组织工程技术可应用于复制各种组织，如肌肉、骨骼、软骨、腱、韧带、人工血管和皮肤；生物人工器官的开发，如人工胰脏、肝脏、肾脏等；人工血液的开发；神经假体和药物传输等方面 一）组织工程化皮肤一）组织工程化皮肤•皮肤损伤主要是热损伤，仅在美国每年大约就有250万人烧伤，其他原因包括慢性溃疡、创伤、皮肤肿瘤切除或其他皮肤疾病•传统的修复方法有：自体植皮、同种异体植皮、异种植皮和人工合成代用品的应用但存在供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点。

•目前，一种生长因子和几种皮肤替代物已经投放市场，作为治疗难愈性溃疡的二线选择l皮肤的解剖生理学•皮肤依构造可分为表皮、真皮及皮下组织,如图所示•表皮最主要的成分是角化细胞，它们由细胞桥粒形成互相结合的重叠结构，使得细胞与细胞互相粘连•真皮的主要细胞是成纤维细胞，产生和维持大部分细胞外基质颗粒层棘层基底层（生发层）乳头层网织层角质层透明层表皮真皮皮下组织l组织工程皮肤•组织工程皮肤:由活性细胞接种在支架材料上形成的组织工程化皮肤，有真皮层或同时具有真皮层和表皮层，因此是一种活性生物敷料•工程化皮肤结构需要复制的关键特性有：Ø①一种具有恰当帮助真皮修复和支持表皮生长能力的真皮或者间质成分；Ø②一层具有容易使创面达到生物覆盖能力表皮；Ø③一层可以使屏障特性快速重建的表皮；Ø④一个准许免疫系统、神经系统和血管系统生长的环境；Ø⑤一种能在结构和附加功能（例如降低长期瘢痕形成和色素重建）方面正常化的组织组织工程皮肤的临床应用•组织工程皮肤是美国FDA批准最早用于临床的产品Ø第一代产品为单层上皮细胞移植，虽然愈合较快，但瘢痕较多，且易发生瘢痕挛缩Ø第二代产品则研制成功了真皮层，成为具有双层结构的新一代产品，其临床效果也得到明显改善。

其代表产品有Dermagraft-TM，Dermagraft-TC和Apligraff（TM）1.)表皮替代物表皮替代物和支持基质•重建表皮重建表皮的方法:细胞悬液→全层皮肤替代物例如：聚硅氧烷膜、活的表皮角质形成细胞Ø1975年，Rheiwald和Green等以3T3细胞作为滋养层采用共培养的方法培养出人类表皮角朊细胞获得成功Ø1981年，O’Connor等首次应用CEA法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片，表皮细胞膜片附着良好•尽管CEA技术是大面积烧伤治疗的一大进步，但单纯CEA移植技术存在一些缺点：Ø如耗时长；Ø细胞膜片菲薄易碎，难以操作；Ø移植到创面后，接受率低，极易造成移植物脱失；Ø即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦，容易发生水泡，造成残余创面2.)真皮替代物真皮替代物和支架材料•真皮替代物的研究是随着CEA的发展而不断引起人们的关注的•研究进展：人尸体皮肤（发生免疫排斥反应、引发潜在感染的可能、移植物的来源以及原料质量的差异性）→去细胞的真皮乳头层深（部真皮和更表浅得乳头层真皮在结构上存在不同）→较深层的网状真皮•组织工程已经研究了通过使用支架和活细胞支架和活细胞来引起肉芽组织形成的可能性。

Ø1980年，Yannas和Burke制成一种人工真皮替代物，网状皮片的获得率也提高到85%～95%ØIntegra Artificial Skin、Biobrane、Dermagraft 、Dermagraft-TC等人工真皮人工真皮相继产生3.)复合人工皮肤:既含有表皮层表皮层又含有真皮层真皮层的组织工程化皮肤• 复合人工皮肤复合人工皮肤:用组织工程方法对所取小量皮肤组织进行消化、分离,表皮细胞、成纤维细胞分别培养和表皮细胞、成纤维细胞分别培养和扩增、达到一定细胞数量后重组成全层皮肤组织（包括扩增、达到一定细胞数量后重组成全层皮肤组织（包括表皮层及结缔组织）表皮层及结缔组织）•组织工程皮肤包括两种活的细胞成分：位于表层的表皮细胞表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞成纤维细胞，不仅具有正常皮肤的部分功能，种植后不易变形，而且具有良好的修复皮肤创伤的作用•Apligraft(又称作Graftskin)是第一种商品化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种由Organogenesis公司注册生产的产品已在加拿大和美国获准用于临床治疗静脉性溃疡.组织工程皮肤展望•用组织工程皮肤移植物作为常规手段治疗皮肤创面已经变为现实，有着极其巨大的社会和商业价值以及广阔的研究和临床应用前景。

•现有的几种组织工程化皮肤虽然在治疗烧伤及慢性溃疡上取得了长足进步，但对组织工程皮肤的研究着重于对表皮和真皮的研究，对毛囊和皮脂腺的研究相对较少二）骨组织工程•目前骨组织工程的研究主要包括：•①种子细胞的体外培养；•②细胞种植基质材料的研究开发；③组织培养中各种因子的调控作用•骨主要由3部分构成：骨膜、骨质、骨髓松质骨骨膜骨密质骨髓•1）种子细胞）种子细胞•来源：皮质骨、松质骨、骨膜、骨髓、骨外组织以及胚胎干细胞•皮质骨、松质骨、骨膜来源的成骨细胞能表达成骨细胞表型且骨膜中含有较多的骨原细胞,而骨原细胞具有分化潜能，可以分化为成骨细胞但它们的成骨细胞存在较多的缺陷,如取材困难、来源有限、扩增能力有限及免疫排斥等•胚胎干细胞具有分化为三个胚层的能力，体外培养后可分化为肠上皮细胞(内胚层) 、软骨、骨、平滑肌、横纹肌(中胚层) 及神经细胞(外胚层) 等,可以大量扩增和定向诱导为具体干细胞，但是存在免疫排斥较强的缺陷•2）细胞种植基质）细胞种植基质•作用：Ø种子细胞提供了粘附、增殖、分化的空间结构和生长模板Ø引导组织再生,控制组织或器官的性状•分类方法：Ø以形态分：纤维状、海绵状、凝胶状等；Ø以来源分：天然生物材料和人工合成生物材料。

•天然生物材料主要有胶原、胶原、脱钙骨基质及经物理化学高温处理的动物骨、纤维蛋白、硫酸软骨素、壳聚糖、藻酸盐几丁质等•人工合成生物材料可以分为人工合成无机材料无机材料和人工合成可降解有机高分子材料可降解有机高分子材料•理想的支架材料具有的特征：Ø三维多孔的连接网络，有利于细胞生长、养分传输和代谢产物的排放；Ø生物相容性和可降解性好，降解速度和吸收速度可以调控，以适应细胞或组织在体内体外的生长；Ø化学表面适合细胞的粘附、增殖和分化；Ø机械性能与所植入组织的要求相匹配ü仿生学材料就是近年发展的趋势，RGD 序列或基因与支架整合后可提高细胞的粘附与增生•3）生长因子）生长因子•作用：Ø具有诱导和刺激细胞增殖，维持细胞存活等生物效应的蛋白类物质；Ø促进细胞增殖，组织或血管的修复和再生ü在骨创伤早期，生长因子主要启动成骨细胞活性，促进成骨，后期作用逐渐减弱，但也参与骨的生长调节ü髓基质中含有多种生长因子：骨形态发生蛋白骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、酸性成纤维生长因子、类胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ、血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素-1等•目前，用组织工程骨修复骨缺损的研究，已从取材、体外培养、细胞到支架材料复合体形成等都得到了成功。

•例如：用自体骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物修复兔下颌骨缺损，结果表明：术后3个月，单独珊瑚组及空白对照组缺损未完全修复；珊瑚-骨髓组和珊瑚-rhBMP-2组及单独骨髓组已基本修复了缺损；而骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物组在2个月时缺损即可得到修复•带血管蒂的骨组织工程：将骨细胞种植于预制带管蒂的生物支架材料上，将它作为一种细胞传送装置•组织工程骨的构建分为：体内构建和体外构建两种形式•体内构建：将成骨细胞-支架复合物植入体内，修复骨缺损•体外构建：通过体外组织培养的方法应用水降解支架材料，接种成骨细胞，构建骨组织骨组织工程的临床应用•骨组织工程的临床应用尚处于起步阶段ØVacanti等利用患者自体骨膜成骨细胞与天然珊瑚复合，用于1例36岁患者左手拇指指骨的再造ØQuarto等用组织工程骨治疗3例长骨缺损的患者Ø杨志明等应用自体骨髓基质干细胞、同种异体骨膜来源的成骨细胞复合同种异体骨在人体内构建组织工程骨，并对52 例病人多个部位的骨缺损、骨不愈合进行了修复骨组织工程展望• 应用组织工程学原理修复骨缺损是一种全新、具有前景的道路，其涉及生命科学、工程学、细胞生物学、免疫学、材料科学等领域，是目前研究的热点。

•主要表现在：Ø①细胞的来源、保存和在移植环境下细胞组织的生长；Ø②多聚生物材料的研究；Ø③生长因子与种植细胞及可降解材料整合后修复骨缺损组织的研究•需要解决的问题：Ø①明确细胞在体外培养中分化、增殖的调控机制；Ø②加强可降解材料整合后修复缺损组织的研究； Ø③明确诱导因子对成骨细胞的作用，掌握成骨细胞的最佳培养密度和迅速增殖； Ø④建立起成骨细胞库及大规模的成骨细胞培养体系；Ø⑤改善细胞-材料相互作用，研究开发优良的基质材料，解决人工聚合材料远不能满足临床标准的问题；Ø⑥解决新生组织不能完全替代原有组织的功能问题；Ø⑦加强新生组织和基因转入的新生组织体内移植方式的研究组织工程存在的问题：组织工程存在的问题：ü目前对组织工程化组织的科学本质还缺乏深刻的目前对组织工程化组织的科学本质还缺乏深刻的认识ü对影响组织形成主要相关因素的作用机制缺乏深对影响组织形成主要相关因素的作用机制缺乏深入的了解入的了解ü具有复杂功能器官的构建研究才刚刚起步具有复杂功能器官的构建研究才刚刚起步。