新一代的流行性乙型脑炎疫苗.doc

新一代流行性乙型脑炎疫苗张 卓 光〔成都生物制品研究所 成都 610023〕摘要 流行性乙型脑炎是疫苗可预防疾病，近年开发新的Vero细胞乙型脑炎疫苗是一个热点本文介绍了五种以Vero细胞为基质的乙脑疫苗，它们的研制情况及特点关键词 流行性乙型脑炎 Vero细胞 疫苗 流行性乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒属于黄病毒科，黄病毒属，1935年在日本别离乙脑病毒颗粒为球形、有包膜，直径45nm左右，其中核心30nm[1]含有一条正链RNA编码一个多聚蛋白，它们分别裂解加工成结构蛋白C、PrM、M、E和非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5E蛋白是乙脑病毒的重要抗原，含有与病毒毒力密切相关的决定性氨基酸，能诱导产生中和抗体[2]它侵犯人中枢神经系统，所致流行性乙型脑炎(简称乙脑)是一种急性传染病，以蚊为传播媒介,主要在夏秋季流行全球每年有约50，000例报告，主要分布于亚洲20世纪90年代以来，乙脑流行区域有所扩大，一些原来为非乙脑流行的国家或地区也发生乙脑流行如1990年美属塞班岛〔位于西太平洋马里亚纳群岛〕[3]，同年7～11月在印度的西北部[4]，澳大利亚最北部的托雷斯海峡〔Torres Strait〕的巴度〔Badu〕岛都首次报揭发生乙脑[5]。

乙脑不仅病死率高〔30%〕，而且后遗症严重，约50%的幸存者有神经系统的后遗症近年国内的广东、广西等地都有局部的爆发流行，现在对乙脑的防治措施主要是防蚊和接种疫苗1954年，日本学者开发出乙脑Nakayama株鼠脑灭活纯化疫苗，86年改为北京-1株[6]；70年代，中国学者开发出乙脑P3株地鼠肾细胞灭活疫苗；89年又研制出乙脑SA14-14-2株地鼠肾细胞减毒活疫苗由于发现乙脑病毒适应于Vero细胞，而Vero细胞无外源因子和易于培养被WHO推荐做为生产疫苗的细胞基质，而以Vero细胞为基质已成功开发了狂犬和脊灰疫苗,并已广泛使用因此，近年中、美、日三国学者都在以Vero细胞基质研制新一代的乙脑疫苗，虽然有乙脑的DNA疫苗〔带有Pre-M+E基因〕等新技术疫苗的报道[7]，但它们的应用还需要一定的时间目前进展最快的，还是以Vero细胞为基质的新一代乙脑疫苗，而且它们有希望大规模应用，现在对它们做一个介绍1、乙脑P3株Vero细胞纯化灭活疫苗北京生物制品研究所的丁志芬等，采用乙脑病毒P3株，在Vero细胞上传代适应，发现P3株在Vero细胞上传10代以后，免疫原性下降故把P3株在Vero细胞10代以内制备毒种和疫苗[8]。

转瓶技术培养Vero细胞和乙脑P3株，滴度一般在7.0LgPFU/ml以上，病毒悬液经灭活、澄清、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、蔗糖密度梯度离心纯化，制备成冻干疫苗其CF抗原在1∶16～32，相当于中国乙脑疫苗标准品〔1∶4〕和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品〔1∶4〕的4～8倍，其蛋白含量在25～29ug/ml，低于日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准〔80ug/ml〕；疫苗效力高于中国乙脑疫苗和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品[9]用此疫苗除初免第1针有一过性发热外〔体温中强反响率为12.4%〕，无其他不良反响免疫2针后1个月中和抗体阳转率和几何平均滴度〔GMT〕分别为100.0%和1∶27.7[10]2、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化减毒活疫苗武汉生物制品研究所吕文利等，用乙脑SA14-14-2株，接种于Vero细胞，3、6天收液，超滤浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、Sepharose4FF凝胶过滤介质纯化疫苗，制成纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗滴度达7.2LgPFU/ml，免疫原性小鼠ED50为10-5PFU，蛋白含量20ug/ml,纯毒试验、外源因子、脑内致病力、乳鼠传代返祖试验全部合格[11]3、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)美国Walter Reed军事研究所Ashok k.Srivastava等，采用乙脑SA14-14-2株在原代狗肾细胞〔PDK〕传8代后的病毒，JESA14-14-2 PDK-8,在Vero细胞上，经传两代后，病毒滴度就增加了1000倍，从4.0LgPFU/ml到大于7.0LgPFU/ml,更多代次未见病毒滴度增加。

以Vero细胞4代建立主种子批，5代为工作种子批，6代为疫苗Vero细胞种毒后，3、5、7、9天收毒，滴度在7.0～8.0LgPFU/ml,第7天的滴度最高病毒原液离心过滤去除细胞碎片，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白处理，蔗糖密度梯度离心，福尔马林灭活，Al(OH)3吸附，加硫柳汞，配制成Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)把Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)与现在国际通用的日本鼠脑纯化乙脑灭活疫苗〔JE-VaX〕，在小鼠模型做免疫原性和保护力比照，半数有效免疫剂量〔ID50 〕JE-PIV是4ng，JE-VaX是15ngJE-PIV引起100%中和抗体阳性的最低剂量是32ng免疫小鼠后，用乙脑SA14株≤1000LD50的病毒量攻毒，需要保护50%的免疫小鼠的半数有效剂量〔ED50〕JE-PIV是2.6ng, JE-VaX是1.5ng保护100%免疫小鼠的JE-PIV的最低剂量是150ng疫苗的纯毒试验，用RT-PCR，分析核苷酸序列与公布的SA14-14-2株比拟，只有5311核苷酸不同疫苗是胸腺嘧啶〔T〕，而公布的SA14-14-2株是胞嘧啶〔C〕此疫苗的优点是：〔1〕Vero细胞培养乙脑病毒，可用无血清培养基并到达较高的滴度〔7.0～8.0LgPFU/ml〕；(2)可反复收毒，易于大规模生产；〔3〕无血清培养基培养乙脑病毒，增加了疫苗的平安性，并可用简易、经济的纯化方法。

在小鼠模型中，JE-PIV较JE-VaX在相同剂量下，都能保护小鼠，JE-PIV有更强的免疫原性JE-PIV平安、有效、经济，将在志愿者中进行I期临床观察[12]4、乙脑北京-1株Vero细胞灭活纯化疫苗日本Chemo-sero Therapeutic Research研究所的Keishin Sugawara等，以乙脑北京-1株，Vero细胞为基质开发出灭活纯化疫苗细胞库：Vero细胞122代购自ATCC，126代建立主细胞库，129代建立工作细胞库然后对细胞库进行生物平安检查合格病毒库：使用无血清培养基培养北京-1株，种毒5天后收毒在第2代建立主种子批〔MVB〕，第4代建立工作种子批〔WVB〕，第9代建立扩大种子批〔EVB〕无菌试验，外源因子检测合格，核苷酸序列分析各种子批都一致为了便于大规模的工业生产该疫苗，开发了一条易于放大的工艺流程采用培养罐、微载体技术培养Vero细胞，5L、50L、500L培养罐逐级放大，种毒后用无血清培养基培养病毒，第3天病毒滴度达顶峰〔9.0LgPFU/ml左右〕，第4天E蛋白酶标抗体〔E-ELISA〕检测达顶峰，第4天收毒去除细胞及碎片，超滤浓缩，福尔马林灭活，蔗糖密度梯度离心，柱层析，再加附加剂制成Vero细胞灭活纯化疫苗。

Vero细胞DNA含量223.0±41.39〔pg/mg〕,ELISA检测Vero细胞的蛋白质〔HCP〕含量159.7±19.60(ng/mg)把Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性做一比拟，见表1表1 Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性比拟疫苗名称电镜观察病毒直径蔗糖密度梯度离心SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳〔SDS-PAGE〕蛋白质印迹〔Western blot〕免疫双向扩散效力〔病毒中和滴度Log10〕免疫血清中和病毒谱Vero细胞46.7±0.19nm病毒都浓缩在43%蔗糖处结果相似都观察到6条带都观察到E抗原呈双带抗原和免疫原性没有差异2.85【2.25】2.87【2.31】两者相似鼠脑46.7±0.43nm2.74【2.25】2.33【2.31】【】：参考疫苗从表1可知，乙脑北京-1株在Vero细胞和鼠脑上制备的疫苗，物理化学特性和免疫原性相似[6]对Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗的平安和效果，进行了动物和I期临床观察在小鼠、狗、兔中一剂量的异常毒性观察，未显示有毒性；致畸性试验，结果阴性两组志愿者各30名血清乙脑抗体阴性〔对乙脑北京-1株中和抗体滴度<101〕，分别接种Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗。

两组局部药物反响，头痛和不舒服轻微，Vero细胞组反响率6.7%，鼠脑组20.0%两组接种3针后，血清阳转率都是100%，几何抗体平均滴度〔GMT〕Vero细胞组是102.35，鼠脑组是102.03[13]5、黄热乙脑嵌合病毒〔ChimeriVax-JE〕Vero细胞减毒活疫苗黄热病毒〔YF〕17D株，制备黄热病减毒活疫苗有60年的平安和有效的使用历史用乙脑SA14-14-2株的结构蛋白PrM和E的基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应位置，而核心蛋白〔C〕、非结构蛋白基因与病毒复制有关的局部，那么保存黄热病毒17D株的基因序列，构成黄热乙脑嵌合病毒〔ChimericYF/JE-S〕在体外转录为RNA后，转染Vero细胞，培养后出现细胞病变或蚀斑经检定证实为感染性嵌合体病毒后，那么可继续传代保存[14]黄热乙脑嵌合病毒〔prM-E〕在脊椎动物和蚊来源细胞上较乙脑SA14-14-2株繁殖良好，在Vero细胞培养五天，滴度到达>8LgPFU/ml，E蛋白仍保存乙脑病毒的抗原性和生物学特性在FRhL细胞上的prM-E基因序列与乙脑SA14-14-2株一致，与乙脑强毒株SA14和Nakayama在包膜上有6 个氨基酸不同〔E107、E138、E176、E279、E315、E439〕。

106PFU脑内注射小白鼠无神经毒性，而黄热病毒17D株在小白鼠神经毒力较黄热乙脑嵌合病毒大黄热乙脑嵌合病毒在细胞传18代，鼠脑中传6代后，与减毒和毒力有关的氨基酸位点都存在，保持不变，显示黄热乙脑嵌合病毒的基因稳定性在小鼠皮下接种≥103PFU的黄热乙脑嵌合病毒一针，就能保护乙脑强毒株的腹腔攻毒在猴脑内接种6.6LgPFU的黄热乙脑嵌合病毒，只引起短暂的病毒血症，没有脑炎病征，引起高滴度的乙脑抗体，能抵御乙脑强毒株的脑内攻毒对攻毒30天后猴的神经组织进行病理检查，没有或仅有轻微的脑炎病理改变；用WHO规定的黄热病毒17D株的猴神经毒性试验，检测黄热乙脑嵌合病毒符合WHO规程标准[15-17]美国Acambis公司的Thomas P.Monath等，用黄热乙脑嵌合病毒，在Vero细胞上培养的3、4和5代分别作为主种子批、工作种子批和疫苗收获Vero细胞培养嵌合病毒的上清液作为疫苗原液，用核酸酶处理以消化Vero细胞的核苷酸，使用500-kDa膜，正切流微过滤和透析过滤纯化疫苗原液，参加乳糖和人血白蛋白做保护剂，制成黄热乙脑嵌合病毒Vero细胞减毒活疫苗Vero细胞DNA<0.1ng/人份〔0.5ml〕, Vero细胞库、嵌合病毒种子库、疫苗经检测无外源因子[18-19]。

黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对小鼠脑内无致病力，以2.0、3.0、4.0、5.0LgPFU的剂量，猴皮下接种所有猴都出现低病毒血症〔平均滴度顶峰，1.7～2.1LgPFU/ml，平均持续时间，1.8～2.3天〕，6～10天开始出现中和抗体，到第30天各剂量组的中和抗体反响相似，对同源毒株中和抗体滴度较异源毒株高在第54天，用5.2LgPFU病毒量的强毒株攻毒，免疫猴都没有引起病毒血症、脑炎病征和轻微的残留脑部损害而对照组，那么出现病毒血症、临床脑炎病征和严重的组织病理损害攻毒后，免疫猴的血清和脑脊髓液中的中和抗体显著升高〔≥4倍〕黄热乙脑。