慢性阻塞性肺疾病患者外周血中性粒细胞凋亡及其与Bak基因关系.pdf

复旦大学硕士研究生毕业论文摘要背景中性粒细胞是慢性阻塞性肺疾病( C O P D ) 患者慢性炎症反应的关键细胞，肺组织中的中性粒细胞数量及活性增加，可能与细胞凋亡延迟有关凋亡基因B c l ．2 家族在中性粒细胞的凋亡中占重要地位该研究探讨慢性阻塞性肺疾病患者外周血中性粒细胞细胞凋亡率的变化及其与凋亡基因B a l 【m R N A 表达的关系方法C O P D 患者2 0 例，其中稳定期患者1 0 例，急性加重期患者1 0 例正常对照组，肺功能均正常，包括吸烟者2 0 例和从不吸烟者2 0 例使用P 即c o l l 非连续密度梯度沉降法分离人外周血中性粒细胞，体外培养4 h 、1 8 h 、3 6 h 后，加入A n n e x mV - F I T C ／P I ，用流式细胞仪检测细胞凋亡率使用半定量R T - P C R 检测中性粒细胞B a l ( 基因m R N A 的水平结果4 h 、1 8 h 、3 6 h 时，C O P D 急性加重组的中性粒细胞凋亡率较其他组低，差异有统计学意义( 尸均 7 0 ％且F E V I > 预计值的8 0 ％) ，包括吸烟者2 0 例和从不吸烟者2 0 例，均为男性。

近2 个月内无呼吸系统疾病史及其他感染的病史通过询问病史、体格检查和既往体检资料未发现明确的疾病史、服药史、过敏史和手术史本研究通过复旦大学附属华山医院伦理委员会审核，所有参加试验者均签署知情同意书二、主要的实验器材天能凝胶成像系统二氧化碳孵育箱电泳及转膜设备流式细胞仪高速低温离心机水平离心机相差显微镜荧光显微镜普通显微镜超净工作台低温冰箱4 “ C 冰箱T a n o n —．4 1 0 0M o d e l5 4 1 0B I O ．R A Dm i n iP R O T E A N3F A C S c a nB e c t o n - D i c k i n s o nE p p e r d o r fG e r m a n yU 1 1 i v e r s a ] 3 2 RE L W 0 0 3B H ．2O l y m p u sS W 二C J ．I F DR E V C O海尔公司复旦大学硕士研究生毕业论文P C R 仪三、主要的试剂来源P e r c o l l 原液6 ％葡聚糖A n n e x i nV - F I T C 凋亡试剂盒R N A p r e pM i c r oK i tT I A N S c r i p tR TK i tB a k 引物p - a c t i n 引物T a q D N A 聚合酶D N Am a r k e rR P M I ．16 4 0P e r k i n ．E l m e r2 4 0 010 0 ％纯度，P h a r m a c i aT 5 0 0 ，P h a r m a c i aA b e a mp i e ，C a m b r i d g e ，U S A北京天根生化科技有限公司北京天根生化科技有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司Q i a g e n北京天根生化科技有限公司H y c l o n eU S A四、试验方法1 ．中性粒细胞的分离和培养’使用P e r c o l l 非连续密度梯度沉降法分离人外周血中性粒细胞【l 】，P e r c o l l 原液的密度为1 ．1 3 0 9 ／m l ，人外周血中性粒细胞在P e r c o l l 中的漂浮密度为1 ．0 8 0 “ - 1 ．0 8 5 ，使用O ．8 7 ％氯化钠溶液配制的6 0 ％P e r c o l l 溶液的密度为1 ．0 7 9 咖l ，7 0 ％P e r c o l l 溶液的密度为1 ．0 9 1g ／m l ，因此中性粒细胞可以被分隔在7 0 ％和6 0 ％之间的液面层。

所有患者抽血前1 2 小时禁止吸烟，于清晨空腹抽肘静脉血1 0 m L ，置于真空密闭肝素钠抗凝管中具体操作步骤如下：( 1 ) 将静脉血转移至1 5 m L 无菌试管．．( 2 ) 4 0 0 9 离心2 0 m i n 3 ) 取( 2 ) 上清液2 0 0 0 9 离心3 0 m i n ，上清液为无血小板血浆( P P P ) ，转移至试管中 4 ) 取( 2 ) 沉淀与磷酸盐缓冲液( P B S ) I ：4 混合，然后按2 ：1 与6 ％葡聚糖( T 5 0 0 ，复旦大学硕士研究生毕业论文P h a r r n a c i a ) 充分混合，沉降6 0 r a i n 5 ) 将P e r e o l l 原液( 1 0 0 ％纯度，P h a r m a e i a ) 与8 ．7 7 ％的氯化钠溶液以9 ：1的体积比混合，配制成1 0 0 ％P e r c o l l ，再用灭菌生理盐水配制7 0 ％和6 0 ％的P e r e o l l 分离液 6 ) 取1 0 m L 离心管，P P P 充分润管后，使用1 0 m L 无菌注射器将7 0 ％和6 0 ％的p e r c o l l 溶液各4 m L 依次贴壁加入1 5 m L 离心管，注意保护界面层。

7 ) 取( 4 ) 沉降后的上清液4 0 0 9 离心1 0 m i n ，弃去上清液 8 ) 取( 7 ) 沉淀物用P P P2 m L 充分溶解，注意避免气泡 9 ) 然后用移液枪吸取8 液沿6 管壁加入P e r c o l l 浓度梯度中，注意保护界面目 ，夏o( 1 0 ) 4 0 0 9 离心2 0 m i n ，吸出白膜层，P B S 洗脱两次 1 1 ) 并用血球计数板对中性粒细胞计数，细胞涂片吉姆萨染色计算中性粒细胞纯度≥9 8 ％，应用苔盼蓝排斥试验检测活细胞i > 9 8 ％ 1 2 ) 取5 ×1 0 5 中性粒细胞加入3 5 0 I _ t L 裂解液，使用匀浆器匀浆3 0 s 后置．7 0 “ C冰箱冻存 1 3 ) 制各含1 0 ％胎牛血清、1 0 0 u ／m L 青霉素和1 0 0 u ／m L 链霉素的R P M I1 6 4 0培养液 1 4 ) 将中性粒细胞加入培养液中配制成浓度为5 ×1 0 5 ／m L 的悬液3 m L ，等分3 份 15 ) 将上液置无菌3 6 孔板中，在温度3 7 “ C 、C 0 2 体积分数为5 ％和相对湿度9 0 ％的孵育箱中分别培养4 h 、1 8 h 和3 6 h 后，取出用P B S 洗脱2 次用流式细胞仪检测。

2 ．流式细胞仪检测细胞凋亡在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酰丝氨酸( P S ) 从细胞膜内层暴露于外层1 2 1 ，从而可被P S 特异的A n n e x i n - V 探针所标记P S 转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏由于碘化丙锭( P I )对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色因此，A n n e x i n - v 结合P I 进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上A n n e x i n ．V ，坏死和凋亡晚期细胞可被A n n e x i n ．V 和P I 同时染色1 3 】使用A n n e x i nV - F I T C 凋亡试剂盒( A b e a mp i e ，C a m b r i d g e ，U n i t e dK i n g d o m ) ，按照说明书操作具体步骤如下：复旦大学硕士研究生毕业论文( 1 ) 计数并收集约2 ×1 0 5 中性粒细胞加入P B S l m L 。

2 ) 加入5 0 0 此A n n e x i n - V 缓冲液 3 ) 加入5 “LA n n e x i nV - F I T C( 4 ) 加入5 “LP I ，在暗室中静置5 m i n 5 ) 使用流式细胞仪( F A C S c a n ；B e c t o n - D i c k i n s o n ) 检测 6 ) 使用软件W i n M D I2 ．9 进行分析流式细胞检测的参数设置如下：光源为4 8 8I l l I l 氩离子激光器，F I T C 的微发光波长均为4 8 8 n m 被激光激发后发射绿色荧光；P I 激发光波长4 8 8 n m ，发射光峰值6 3 0 n m ，被激光激发后发射橙红色荧光3 ．半定量R T - P C R试剂使用R N A p r e pM i c r oK i t 和T I A N S c r i p tR TK i t ( 北京天根生化科技有限公司生产) ，T a q D N A 聚合酶( P r o m c g a ) 根据基因库中c D N A 序列，用P r i m e rP r e m i e r5 ．0 软件设计引物序列。

B a k 引物序列为：上游引物5 ’一T C C A G A T G C C G G G A A T G C A C T G A C G一3 ’，下游引物5 ’一 T ( 舢G G 後A T G G G C T C T C A C A A G G 一3 ’，目标产物长度为l17 2 b p ；内参使用[ 3 - a c t i n ，引物序列为：上游引物5 ’一C T G T C T G G C G G C A C C A C C A T 一3 ’，下游引物5 ，’G C 丸气C 吖姨G T C 御隗G T C C G C 一3 ’，目标产物长度2 5 4 b p ，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成1 ) R N A 提取：使用R N A p r e pM i c r oK i t ，参照试剂盒说明书操作具体步骤如下：( 1 ) 取出冻存的含中性粒细胞的裂解液，加入3 5 0 p L7 0 ％乙醇，使用移液器混匀 2 ) 将其转移至吸附柱中，置2 m LR N a s e ．f r e e 收集管中1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 s ，弃废液 3 ) 向吸附柱中加入3 5 0 皿去蛋白液R W l ，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 s ，弃废液。

将吸附柱放回收集管中 4 ) 向吸附柱中央加入8 0 此的D N a s eI 工作液，室温放置1 5 m i n( 5 ) 向吸附柱中加入3 5 0 皿去蛋白液，1 2 0 0 0r p m 离心6 0 s ，弃废液将吸附柱放回收集管中 6 ) 向吸附柱中加入5 0 0 此含乙醇的漂洗液R W ，静置2 r a i n ，1 2 0 0 0r p m 离心6 0 s ，弃废液 7 ) 重复步骤( 4 ) 8 ) 将吸附柱放回收集管中，打开盖子，1 2 0 0 0r p m 离心2 m i n ，去除残留液复旦大学硕士研究生毕业论文体 9 ) 吸附柱室温静置片刻，充分晾干后放入新的R N a s e ．f r e e 离心管中 1 0 ) 向膜中央加入1 4 此R N a s e ．f r e ed d H 2 0 ，静置2 m i n 1 0 ) 1 2 0 0 0r p m 离心6 0 s ，所得溶液即R N A 溶液 1 0 ) 使用分光光度计测算R N A 溶液浓度2 ) 第一条e D N A 链的合成：使用T I A N S c r i p tR TK i t ，参照说明书操作。

具体步骤如下：( 1 ) 制备以下反应体系总R N A0 ．5 烬o l i g o2 此d N 什2 止加入R N a s e ．f r e ed d H 2 0 定容至13 ．5 此( 2 ) 7 0 ℃加热5 。