免疫荧光染色技术.pdf

免疫荧光染色技术标签: 荧光免疫染色技术2009-04-07 22:28最近看了几篇文章，文中都涉及一项技术叫：免疫荧光染色感觉这项技术不错，实验的图片经过染色很漂亮，再一merge，更加说明问题，今日网上搜来有关介绍，恶补一下竟觉也不是和特别，所谓难者不会，会者不难，大概也就是如此了将该项技术介绍如下：（转载）荧光免疫染色和DAPI 染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性二抗可以特异性识别一抗的Fc 区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况( 核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上) ，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6- 联脒 -2- 苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA 双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合结合后产生的荧光基团的吸收峰是 358nm而散射峰是461nm ，正好 UV （紫外光）的激发波长是356nm ，使得 DAPI成为了一种常用的荧光检测信号Jagielski M. et. Al在 1976 年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验本实验就是利用DAPI 染色标记细胞核的位置免疫染色实验方法和步骤免疫染色 (immunol staining)包括免疫荧光 (immunol fluorescence)、免疫组化 (immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作1. 样品准备 (Sample preparation) 对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6 孔板、 24 孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。

也可以用洁净的盖玻片，70% 乙醇中浸泡后， 用无菌的镊子放置到6 孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上然后就可以进行后续操作如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力对于冷冻切片：Frozen Sections切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作对于石蜡切片：paraffin section脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5 分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3 次无水乙醇5 分钟，两次 90% 乙醇 5 分钟，两次，70％乙醇 5 分钟，一次蒸馏水5 分钟，两次抗原修复： 根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM 柠檬酸钠，pH6.0， 或 1mM EDTA ， pH8.0， 或 10mM Tris, pH10.0，95℃加热 12 分钟，大约在30 分钟内缓慢冷却至室温2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液 (P0098) 。

固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106) 洗涤两次，每次 5 分钟3. 封闭 (Blocking) 加入免疫染色封闭液(P0102) ，封闭 60 分钟如果背景较高，可以4℃封闭过夜从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数4. 一抗孵育 (Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103) 稀释一抗用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07) 吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜回收一抗 加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5 分钟吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5 分钟共洗涤3 次如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

5. 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色 ( 非荧光 ) 二抗稀释液 (P0110) 稀释辣根过氧化物酶 (HRP)或生物素 (Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP) 标记的二抗 辣根过氧化物酶 (A0201/A0208/A0216) 可向碧云天订购用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时回收二抗加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5 分钟吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5 分钟共洗涤3 次如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数6. 蛋白检测 (Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物， 或 AB检测体系等进行后续检测7. 多重染色 (Multiple staining) 如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。

多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色例如用免疫荧光染色试剂盒 - 抗小鼠 Cy3(P0193) 进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒 - 抗兔 FITC(P0186) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用 Hoechst 染色试剂盒 (C0003) 对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光用 HE染色进行复染：免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE) 染色试剂盒 (C0105) 进行 HE染色。