流行性脑脊髓膜炎实验室诊疗.ppt

流行性脑脊髓膜炎实 验室诊断 天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义 何谓流行性脑脊髓膜炎？ •流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由 脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides ，Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性 脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行, 患者以儿童为多见，现在成年人发病有 增多趋势人受Nm 感染后大多数表现 为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑 患者 •正常人群中Nm带菌率可达5～ 30%带菌 者为流脑流行的重要传染源 •细菌经飞沫传播，患者潜伏期1～ 4天，其发 展经过可分为三期： 1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染， 有时局部有炎症 2.少数细菌侵入血流，造成单纯 菌血症 ，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐 等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血 点 3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊 髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头 痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症 状 适宜的检测样品 •鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出 液、血清及脑脊液等 •其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤 出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为 确诊依据。

样品采集与运送 样品采集（一） •脑脊液：无菌操作，吸出CSF 3~5mL，立即放 到无菌试管内离心(2000～ 3000r/min，30min) ，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10 ％羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测 Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测)，5 ％二氧化碳环境37℃培养24～ 72h，每日检查 细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定 样品采集（二） • 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操 作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内 注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出 血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其 置于一20℃待测)，同上述条件培养24~72h， 每日进行分离培养 样品采集（三） •淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或 淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液 ，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄 糖增菌肉汤管中增菌8~12h后分离培养或 直接接种10％羊血巧克力色琼脂；涂片 ，干后革兰染色，直接镜检 样品采集（四） •咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两 侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养 基或巧克力双抗平板，也可将咽拭 子放入液体双抗增菌管内，增菌8 ~ 12h后分离培养 。

咽拭子接种 咽拭子接种 不合格咽拭子接种 不合格咽拭子接种 样品的处理和运送 •早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早 期样品，这可以明显提高病原的检出水平 •及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若 无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接 种培养 •保温运送：应尽可能保持样品处于20~36℃之 间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本 除外） 流脑病原学检查方法 生长特性 •脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初 次分离时需5~10%的二氧化碳环 境才能生长，最适生长温度为37 ℃ 菌落特征及菌体形态 •菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上， 5%CO2，37℃ 培养24小时后，其菌落 直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、 圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、 无色素 •细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和 肾形，0.80.6大小常成对排列，邻近 两边扁平凹陷 菌 落 特 征 菌 落 特 征 脑 脊 液 涂 片 生化特征 •分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气 •不分离蔗糖、果糖和乳糖 •过氧化酶和氧化酶阳性 血清分群鉴定 •检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价 Ⅰ、多价Ⅱ、多价Ⅲ抗血清检测，如果 阳性再用分群血清（A群、 B群、C群、 W135群抗血清等）检测。

•不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血 清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌 •在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血 清分群 菌种保存 •短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保 存，可保存7天 •2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥 所有的细菌都可在-70℃冰箱中冷冻保存 将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化 碳培养箱中35～ 37 ℃孵育18～ 20小时，收集 细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中 将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基 中70 ℃低温冰箱分类保存 流脑血清学检查方法（一） •玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm 病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群 Nm诊断血清：国产售品有多价Ⅰ（包含 A、B、C、D群），多价Ⅱ [含1889（Y ）、 1890（H）、1892（29E）]，多价 Ⅲ[含319（W135）、1916（X）、1486 （I）、1811（K）群]及各群单价血清， 共计14种括号内为国际编码） 流脑血清学检查方法（二） •酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用 ELISA间接法测病人急性期和恢复期血 清中抗A群流脑IgG的抗体水平。

此方法 也可以应用于健康者血清抗体的测定 若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈 现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义 流脑血清学检查方法（三） •杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC 法)测定病人急性期和恢复期血清中对 Nm的杀菌抗体水平此方法也可用于健 康人群的血清抗体测定 流脑其它检查方法（一） •胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病 人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗 原，辅助流脑临床诊断可用市售的脑 膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公 司的试剂盒）方法：一滴乳胶试剂（ 30μl）加上一滴病人的脑脊液，涂匀， 在2分钟内出现明显凝集者为阳性 流脑其它检查方法（二） • PCR检测：应用PCR检查病 人急性期血清或CSF中Nm的 DNA特异片段，对流脑病人 进行早期诊断 培养基制备 •巧克力色血液琼脂： 成份：营养琼脂（pH7.6） 100ml 脱纤维血 5~10ml 制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入 羊血，摇匀置水浴锅内，维持在 90℃20~30min待培养基冷至50 ℃ 时才倾注 平板如做病人密切接触者或健康人群带菌调 查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘 菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg 。

卵黄盐水 •将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消 毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无 菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清 全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个 烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理 盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈 乳状分装试管，56 ℃ 加温30 min ，置 37 ℃ 作无菌试验脑膜炎双球菌保菌 用） 诊断试剂 •1、诊断血清：中国CDC传控所呼吸道细菌室 流脑组（北京昌平流字五号）或中国药品生物 制品检定所（天坛西里2号） 2、巧克力平板：自制或市售 3、多粘菌素或万古霉素：北京陆桥技术有限 责任公司有售 4、胶乳凝集试剂盒：法国梅里埃公司有乳胶 凝集法脑膜炎检测试剂盒可测定A群、B群及 C群流脑，所用材料为病人脑脊液 谢 谢 2006.08.23 。