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第三章 DNA的复制,第一节 半保留复制的验证 半保留模型（semiconservative model） 全保留复制模型(conservative model) 分散模型(Dispersive model)验证半保留复制的实验,一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验,图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验 (a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示第二节 复制原点、方向和方式,一. 复制原点 定义 DNA分子上复制开始的特定位置叫复制原点常用ori或o表示 E. Coli的复制原点位于ilv基因附近，是约245bp的一段序列 2. 特点 富含A•T ，与SSB结合 3.原核生物（一个）和真核生物（多个）DNA的复制无一例外的都是从复制原点开始二. 复制方向 1. 双向等速复制 E.coli,真核生物的染色体复制 2. 双向不等速复制 枯草杆菌等 3.单向复制 质粒Col E1 等图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多,三. 复制方式 1.眼型 线状双链DNA的复制:单眼或多眼。

2.θ型 环状DNA分子双链单向、 双向复制均可形成如E. Coli 的复制3.滚环型（σ型） 双链环状DNA分子单向复制的一种特殊形式 DNA复制开始于复制原点处单链的切割，单链5΄端被单链DNA结合蛋白覆盖，而3΄-OH端在DNA聚合酶的作用下以未切断的一条环形链为模板不断延伸整体上DNA的复制是5΄端不断地甩出3΄端不断地延长，好象中间的一个环在不断地滚动一样，因而叫滚环复制其形状象希腊字母σ，因此又叫σ复制 连环分子：在σ型复制中，被甩出的链到达一定的长度后也开始复制最终可得到一种是原来DNA分子若干倍的中间产物，这样的一个分子就叫连环分子,4. D环复制,环状双链DNA分子进行单向复制的特殊方式发现于动物线粒体DNA的复制 双链环在复制原点解开，进行单向复制两条链合成高度不对称，一条链上迅速合成其互补链，另一条则为游离的单链环（即D-环）第三节 原核生物复制的酶学,DNA合成酶 DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引 物提供3'－OH； （3）合成的方向都是5‘→3’ （4）除聚合DNA外还有其它功能表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶,,,(一). DNA聚合酶I的结构,DNA聚合酶有6个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (3) 引物3‘－OH结合位点； (4) 底物dNTP结合位点； (5) 5‘→3’外切酶位点； (6) 3'→5'校正位点。

二). DNA聚合酶Ⅰ的功能,1. 5‘→3’聚合功能 2. 3‘→5’外切活性 3. 5‘→3’外切活性（游离的5端；配对） (1)切刻平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转辙（template-switching） 4. 内切酶活性 5. 填充缺口,,(三). DNA聚合酶II,1.结构 分子量为90KDa，由polB基因编码 2. 功能 3‘→5’外切活性 5‘→3’聚合酶活性,(四)DNA多聚酶Ⅲ的结构,功能： 1. 5‘→3’聚合功能 2. 3‘→5’外切活性 3. 5‘→3’外切活性（游离的5端；单链DNA） 无： (1)切刻平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转辙（template-switching） 4.填充缺口,二. DNA连接酶,其作用机制是分三步进行： 1、E＋ATP→E－AMP＋ppi 在E.coli中， E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸） 2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使其活化 3、活化的5‘－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’ 磷酸二酯键，并释放出AMP。

可以链接单链吗？,三. 单链结合蛋白,又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein） 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚体存在 分子量为74 kD （1）SSB之间的相互作用； （2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构四.解旋酶(helicase),五. 旋转酶,α2β2组成，产生负超螺旋来消除DNA复制中由于双链的解开产生的正超螺旋第四节 DNA复制的半不连续性,半不连续复制的概念 特点 两条子代链的生成方向都是从5΄→3΄； 两条子代链一条是连续的（母版3΄→5΄），一条是不连续的（母板是5΄→3΄）； 两条子代链合成的速度大体相同； 连续合成的链总是领先于不连续合成的链，因此前者称为先导链；后者称为后随链; DNA聚合酶（PolIII）实现了先导链和后随链的同时复制三.相关概念 引物：1-10个核苷酸组成的RNA,需要1或多条； 引发酶：合成RNA引物的酶E. coli dnaG编码； 引发体：无或低活性的引发酶与有关蛋白质结合形 成的一个有活性的复合体； 转录激活：RNA聚合酶通过转录作用解开局部的DNA 双螺旋，进而引发体结合到解开的单链 的特定序列上，合成引物，启动DNA的 复制，该过程被称为转录激活。

RNA聚合酶作用：产物直接充当引物、解开双链， 供引发体结合合成引物四.冈崎片断的连接 带有引物的冈崎片断之间存在缺刻或切口； PolI发挥5’-3’核酸外切酶活性切除RNA引物（RNAaseH参与），同时发挥5’-3’聚合酶活性进行切刻平移或缺口填充； DNA连接酶连接切刻两边的相邻核苷酸，产生一条完整的DNA分子五.复制叉处发生的反应,（1）PolIII全酶在两条新生 链上进行的聚合反应； （2）DNA引发体和成引物RNA； （3）PolI和DNAaseH切除引物 并填充缺口； （4）DNA连接酶将一个个冈崎 片断连接到后随链上； （5）DNA螺旋酶解开双链； （6）ssb蛋白结合到解开的 单链上； （7）DNA解旋酶产生负超螺旋 消除复制叉前进所产生的 正超螺旋六.E.coli复制机构的复杂性 dnaA：复制起始，作用于oriC； dnaB：引发体组分，6聚体，具有螺旋酶活性； dnaC：引发体组分，6个单体分别结合在6个 dnaB六聚体上； dnaE：PolIII的核心蛋白，具有聚合、校对的 功能； dnaG：引发酶，合成引物，单体； dnaN：PolIII全酶的β亚基，“夹子”；,dnaQ：较高的保真度，Pol III的ε亚基； gyrA/B：DNA旋转酶αβ亚基，引入负超螺旋， 消除正超螺旋； rep：螺旋酶，解链； ssb：单链结合蛋白，4聚体，防止链间和链内 氢键形成； i,n,n’,n’’：引发体及预引发体组分（引物合成 有关）。

第五节DNA复制的起始,前导链和后随链合成的起始 一、前导链合成的起始 1、从新起始 在复制原点外，RNA聚合酶进行转录激活，解开双链，引发体结合上去，合成一段RNA引物，从而起始DNA复制1）复制原点与复制起始 所有基因组DNA的复制都是从原点开始； DNA复制时，在复制原点外先形成一个复制泡：先导链一经引发并开始合成，与模板形成双链结构；另一亲本链被置换出来，形成三元泡状结构，又叫置换loop/D-loop； 先导链继续延伸，另一条链的特殊序列被置换出来，预引发体形成（i,n’’,n’, DnaB），引发体形成（引发酶结合），合成引物，开始复制2）OriC与E.coli DNA复制的起始 ①oriC的结构特征 oriC是E. coli的复制原点，245bp，与复制 的起始、终止和染色体在子代细胞之间的分配有关其结构特征如下： a、（A+T）含量占56%，相对较低； b、除碱基序列高度保守外，某些部分碱基的数目十分保守92，+155，+244位点允许突变，不允许插入和缺失碱基；,c、在oriC中，含有9-14个GATC位点（E. coli为11个）其中A的甲基化是复制所必需的； d、有4个高度保守的DnaA识别位点：R1、R2、 R3、R4。

其中R3是R1的正向重复序列，R2是R4的正向重复序列，而R1与R4是互为完全的反向重复序列； e、在oriC中，没有大于20个密码子的开放阅读框② E. coli DNA复制的起始 a.转录激活 RNA聚合酶结合于16KDa基因的启动子P1和asnC基因的启动子P2，解开双链，发动转录，并终止于oriC（自右向左）转录的产物或引发体合成的RNA作为复制的引物 b.起始复合物的形成 形成条件:负超螺旋的oriC、ATP、DnaA、HU蛋白、TopI负超螺旋的oriC：消除解链过程形成的正超螺旋； ATP：只需ATP的存在，不水解； DnaA：结合于R1-R4位点； HU蛋白：识别并刺激oriC的复制； TopI：oriC特异性复制必需的c.预引发体的形成 DnaB-DnaC六聚体与oriC结合形成的 d.RFI*的形成 在DnaB的螺旋酶活性和DNA旋转酶作用下，以水解ATP为能源：DNA出现大范围的解链（ssb蛋白结合单链），oriC区域的负超螺旋数提高10-15倍这样就形成一个迁移率很高的复制形式RFI*（replicative form I*）e.引发体的形成 高度解链的模板与蛋白质的复合体促进DNA引发酶结合到预引发体上，形成引发体，合成引物。

f.DNA的合成 PolⅢ全酶执行：α亚基聚合酶；ε亚基3’-5’外切酶活性（校对）；β亚基使酶结合到模板链上，保证了全酶很高的进行性③λ噬菌体DNA复制的起始 a. 噬菌体λDNA早期复制为θ型复制，晚期为滚环型复制这里我们只讲早期复制 b.复制原点的结构 4个高度保守的由19bp组成的正向重复序列，称oriC重复序列； 约40bp组成的富含AT序列（80%）； 28bp的回文序列，中间4bp的不对称部分 与复制密切相关的是前两个区域c.复制的起始 PROR处发动转录激活 引起起始区结构的变化（解链），ssb蛋白结合，转录了复制所必需的基因产物：O蛋白和P蛋白O蛋白体的形成 4个O蛋白与DnaA作用相似（复制起始有关），它与ori区域的4个正向重复序列结合 引发体形成 2个P蛋白相当于DnaC，可促使2个DnaB与ori结合，引发酶加入进来，合成引物 DNA合成 PolⅢ全酶在富含AT区实现了RNA向DNA的转变④ T7噬菌体DNA复制的起始 39936bp，线状双螺旋 a.复制原点 位于基因1和基因1.1之间，包括基因1.1的两个启动子序列（23bp高度保守）和一段61bp富含AT（78%）序列（7个回文序列TTAA、一个基因4产物的识别位点3’-CTGGG-5’）。

b.参与复制起始的酶 3种：T7 RNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、基因4蛋白 T7 RNA聚合酶：基因1产物，单肽链，转录激活； T7 DNA聚合酶：两个亚基构成（1:1比例结合） T7的基因5蛋白：单链、3’-5’外切酶活性、低的 聚合酶活性（1-50b）； 寄主基因硫氧还蛋白：结合后，具有单双链3’-5’外 切酶活性、聚合酶活性（进行性）很高 基因4蛋白：2种形式(58KDa,66KDa), 具有三磷 酸酯酶、螺旋酶、引发酶的作用c.复制起始过程 转录激活：T7 RNA聚合酶利用基因1.1的2个启 动子中的任何一个发动转录，合成 复制的引物； RNA-DNA的转换：转录产物RNA延伸到AT区域的 某一位点时，被T7 DNA聚合酶 作为引物开始先导链的合成；,后随链的起始：由于转录作用置换出一条单链（后随链的模板链），基因4蛋白迅速结合上去，沿着模板链5’-3’方向移动（能量来自三磷酸酯酶水解dNTP产生的能量），移动过程中，发挥螺旋酶作用解开双链使另一条链能顺利复制当基因4蛋白遇到5’-GGGTC-3’或5’-TGGTC。