定量PCR基本原理及方法ppt课件.ppt

定定 量量PCR根根本本原原理理及及方方法法基因基因 黄妤黄妤1荧光定量光定量PCR根本原理根本原理2荧光定量光定量PCR标志方法志方法3荧光定量光定量PCR不同方法学的运用不同方法学的运用内内容容 Ø 定量定量PCR技技术的的产生生Ø1992年年由由Higuchi等等人人第第一一次次报告告：：运运用用EB参参与与PCR反反响响体体系系，，经改改装装的的带有有冷冷CCD的的PCR仪检测样品的品的荧光光强度度Ø核酸核酸 ↔ 染料染料荧光光Ø后后来来用用与与双双链DNA有有更更强结合合力力的的SYBR Green I取代取代EB1荧光定量光定量PCR根本原理根本原理Real-time ChemistriesPCR的的实际实际方程：方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：：扩扩增增物物数数量量；； X ：：起起始始模模板板数数量量；；Ev：：扩扩增增效效率率；；n：：扩扩增循增循环环数数1. 终点法定量原理点法定量原理前提：在最正确前提：在最正确实验、循、循环次数次数n一定、一定、Ev一一样原理：根据原理：根据扩增增产物的量物的量计数反响物中原始分子数，即：数反响物中原始分子数，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数常数)2. 实时检测法定量原理法定量原理前提：在最正确前提：在最正确实验、一、一样Ev以、以、扩增增产物量一物量一样原原理理：：反反响响物物中中原原始始分分子子数数〔〔X〕〕与与其其所所需需求求的的扩增增循循环次次数数〔〔n〕〕成反比，由此成反比，由此计算出算出标本中靶分子的准确含量，即：本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、、b为常数常数)Ø 荧光定量光定量PCR的定量原理的定量原理阈阈值值：：PCR扩扩增增信信号号进进入入相相对对稳稳定的对数增长期时的荧光值。

定的对数增长期时的荧光值阈值〔阈值〔threshold〕的设定〕的设定PCR efficiency=[10(-1/slope)]-1Where slope=1/mSlope -3.322100%efficiencyPCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期〔对数期〕，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的Ct值——n：：扩增循增循环数数ü n: 扩增循增循环数确数确实定定logN=log N0 +nlogE n=Ct每个模板的每个模板的Ct值与与该模板的起始拷模板的起始拷贝数的数的对数存在数存性关系利用知起始拷性关系利用知起始拷贝数的数的规范品作出范品作出规范曲范曲线，根据未知，根据未知样品的品的Ct值，即可，即可计算出算出该样品的起始拷品的起始拷贝数 ü Ct值与起始模板的关系与起始模板的关系Y轴—Ct值X—起始拷贝数的对数规范曲范曲线由系列稀由系列稀释的知的知浓度的度的样品做品做规范曲范曲线计算待算待测样品的初始模板品的初始模板浓度度log N0 =-Ct logE+logNü 绝对定量定量——未知未知浓度的度的样品与品与规范曲范曲线相比相比较l 内内掺式染料式染料 SYBR Green I, LC Greenl 序列特异性探序列特异性探针 Taqman l Molecular Beaconsl FRETl 引物特异性探引物特异性探针Amplifluor (Intergen)l LUX2荧光定量光定量 PCR 标志方法志方法5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission内内掺式染料式染料 SYBR-Green I 5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission内内掺式染料式染料 SYBR-Green I RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRRQRExcitation双双标志探志探针〔〔Taqman Probe〕〕RQExcitationRRExcitationEmission分子信分子信标〔〔Molecular Beacon Probe〕〕Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量光共振能量传送〔送〔FRET Probe〕〕3荧光定量光定量PCR不同方法学的运用不同方法学的运用Ø 研研讨目的目的Ø 标志方法志方法l 定量分析〔基因拷定量分析〔基因拷贝数的数的绝对定量，基因表达定量，基因表达调控的相控的相对定量〕定量〕l Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etcØ 研讨目的l 基因型分析〔基因型分析〔SNP、突、突变型分析〕型分析〕l Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Greenl 熔解曲熔解曲线分析分析l Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET某科研用户运用Rotor-Gene 3000进展基因表达检测结果 〔自备规范品，检测样品做复管〕l 绝对定量定量某科研用户运用Rotor-Gene 3000进展基因表达相对定量分析，以下图为用∆∆Ct法得出的分析结果 。

〔自备规范品，检测样品做3次反复复管〕HouseKeeper GeneGene of Interestl 相相对定量定量利用溶解曲线进展实验条件的优化〔RG3000〕l 熔解曲熔解曲线分析分析Annealing at 60℃Annealing at 63℃Ø 标志方法志方法l Taqmanl 定量分析，基因型分析l Sybr-Greenl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析 (LC Green)l Molecular Beaconl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l FRETl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l Ampliflour Probe，LUXl 定量分析Ø 基因型分析基因型分析l利用利用扩增信号的种增信号的种类来分型来分型 —— Taqmanl根据熔解曲根据熔解曲线的不同来分型的不同来分型 —— FRET, Molecular Beaconl LC Green双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针〔分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素〔Flr〕标志，而野生型探针那么用不同的荧光物〔Tet〕标志。

假设只需一种信号被扩增出来，那么样本为对应的基因型〔野生型或突变型〕的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，那么样本为杂合型l 利用利用扩增信号的种增信号的种类来分型来分型杂合型野生型突变型 FRET探针进展熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传送而信号加强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱经过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线由于发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，经过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型l 利用熔解曲利用熔解曲线检测基因突基因突变杂合型野生型突变型利用内掺式染料进展高分辨率熔解曲线〔HRM〕分析基因型HRM根据序列长度、GC含量和互补性分析样品，可准确到单碱基差别相比其它方法节约了探针和标志的费用上图：用内掺式染料〔无探针〕区分ACTIN3〔R577X〕SNP基因型〔C到T替代〕同源野生型、突变型及杂合样品如下图〔10次反复〕，由随机软件自动分型片段预先进展40个循环的快速扩增〔<40分钟〕l 利用熔解曲利用熔解曲线检测基因突基因突变谢谢！！专才效力专家。