基因工程重组人干扰素.docx

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素： IFNa、IFNB、IFN t、IFN «来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长免疫调节（较弱）其中IFN-a为多基因产物，有23种以上的亚型II型干扰素：干扰素Y（IFN ）来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节> 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力> 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性> 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答> 趋化作用> 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HulFN），小鼠干扰素（ MuIFN）免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、 T 细 胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用•对巨噬细胞的作用：IFNy可使巨噬细胞表面MHCII类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤 细胞•对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应在抗原致敏之前使用 大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制 作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免 疫增强的效果。

在适宜的条件下，IFN Y对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖o IFNy能增强TH1细胞的活 性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此 抑制体液免疫功能IFN Y不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑 制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgEo•对其它细胞的作用:IFNy对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCII类分子的细胞（如血管内皮细胞、某 些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCII类分子，发挥抗原递呈 作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分 化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞二 重组干扰素的临床应用•广谱抗病毒活性（rhuIFNa）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎•直接抗肿瘤活性（rhulFNa）毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi 肉瘤、非霍奇金淋巴瘤•免疫调节活性一一治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNY）•多发性硬化症rhuIFNB对已知基因序列的干扰素 , 基因文库的调用可以用其序列 3' 端和 5' 端部分事先用同位素 标记过的序列作为探针 , 通过杂交的方法进行调用。

由于干扰素基因 的种属特异性不是很大 ,| 可以用人的干扰素基因为同源探针 , 从鼠 基因文库中调出相应的干扰素基因 , 其方法将在下文 1 中提到 | 对于扰素基因的取用 , 不仅可以使用构建基因文库的方法 , 对已了 解其氨基酸或核昔酸割 成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的 DNA 序列 , 再 对其进行表达化学合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法两大类 与利用基因文库的方法相比 , 化学合成法比较 | 复杂 , 由于每加入 一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况 , 并且在 l 整个合成过程中这种错误不断积累 , 因此该方法适合比较 短的基因 , 而对长的基因则有目的产 | 物含量低、产物纯化困难的缺 点但它也有优点 , 如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点 | 突 变 , 或根据宿主菌的特性 , 在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿 主的偏爱密码子 , 以提高 | 产物的产量 | 对于不同亚型的干扰素 , 由于同源性较高 , 可以用相同的引物从诱导的小鼠细胞系中提取mRNA 混合物进行反转录和扩增 , 然后用亚型特异性探针对 CDNA 混 合物进行 Southern 印迹 , 这样便可将序列上相差较小的同种、不同 亚型的干扰素基因进行分离 , 为生产高纯度的单一干扰素提供了方法 O三、表达方法随着对干扰素研究的深入 , 人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位 于氨基酸序列上的10~40 位、 78~107 位、 123~166 位的 A 、 B 、 C 区 , 尤其是位 于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒 | 活性十分重要。

而人 IFNt1 的 121~136 位对抗病毒活性作用较大 , 人 IFN 子的 N 端 10 个集 | 基酸也是保持其活性所必需的对干扰素结构的了解为更好地构建基因 表达奠定了基础干 | 扰素最初是用其外源序列进行表达的 , 但近年 来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素 , 因此出现了较多的嵌合表达形式 , 并取得了较好的效果1.IFN- a的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、 生产周期短、夕阳基因表达量高的优点 , 同时由于家蚕为真核生物 , 能对表达产物自行进行糖基化修饰 , 产生有生物活性的蛋白 , 并且 在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆 , 再进行抽提即可 , 操作 上十分方便 , 因此 , 它在基因工程领域内被广泛应用下面便以人 IFN, a 的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用 用家蚕核型多角病毒 BIIINPV 体外感染的家蚕传代细胞株 BM-N 通过 噬菌斑法纯化得到BmNPV的T 3亚型利用从感染脂肪体mRNA制得的 CDNA 为探针 , 对其多角蛋白序列进行检验 , 其中 10.5kb 的 EcoR I 片段及 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交 , 将 10.5 灿的 EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 产生质粒 pBmE360 对其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 （ 图 123 中为黑色框架 ）, 将该片段插入 pUC9 的 HindE 位点 , 产生质 | 粒 p9H18 。

将 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶缓冲液中 23 C水浴10min,更|掐锺油油菲如n入07倍他烈的气mnlAd EDTA 终止反应将截短的 p9H18 片段用 HindEi 切 , 并通过琼脂糖 凝胶电泳分离 2.7kb 的 Hind 皿平头末端片段 , 将其插入 pUC9 即 p9B310的 Hind HI-Sma I 位点 O 另外 , 将 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片 段连接到 pUC8 上 , 得到质粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat E 切 , 得 含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 将其连接到 p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 产生杂交质粒 p89B310, 它在启动子下游含有多聚接头 （EcoR I 、 BamH ISma I 、 SalI 、 Pst I 位点 ） 将从基因文库中用 183bp 探针调出的在 ATG 后含有 SmaI 位点（即有序列CCCGGGATG）的IFNm a J基因片段连接到p89B310 上 , 便构建成质粒 pIFN2B310 。

将 pIFN2B310 与病毒基因组 DNA 便 可共转染 BM-N 细胞系或家蚕幼体 , 其具体操作如下 : 向 2.5mL 含 有 0.25molACaCI2、10 p g BmNPV DNA 及 65 p g plFN2B310 的 溶液中加含 0.28II1014NaCl 、 0.7mmoi/L Na2C03 、 0.7IIIII1014 Na2HP04 、50mmol/L EfEPE (pH 7.1) 的缓冲液 , 进行沉淀取 0.45ml 沉淀加至4.5mi含3 X 106个细胞的培养液中，12h后换液一次, 再培养 4d, 即可得到重组病毒 BmIFN2B310 用两个噬菌斑单位的病毒感染3 X 106个BM-N细胞或用50 p L3 X 105 个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体 , 培养 24h 后收集培养 液便可得到干扰素2.IFN- 目的表达将人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人载体 pSV2-dhfr 中 SV40 晚期启动子 PL 下游的 Pvu E 位点用此重组质粒与带有黄 瞟岭磷酸核糖转移酶 (XGPRT) 基因的质粒 pSU--gpt 共转染次黄瞟岭 磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 细胞 O 经 过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选 , 便可得到表达人 IFN-R 。

具体操作 步骤如下 : 将含有人 IFN-p 基因的重组质粒 pBV-92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分别作为探 针模板及插入片段 , 同时用 PvuII 切载体 pSVZdhfr 质粒 , 使其线 性化后将外源基因插入将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的 sp2/0 细胞在含有 10% 小牛血清、 10% 青链霉素的 DLfEM 培养基中传 3~4 代后在小空斑瓶中培养 24h, 成半悬浮状 ,400r/ 勺 1in 离心 5min 将细胞沉积加入新鲜培养基 , 再培养 2~4h 转染液中含目的基因 pSVHIF 和标记基因 pSVZgpt( 比值为 10:1), 其中 DNA 浓度为 20 p g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 阵、 10mmolATris-HCl(pH7.1)428 p L 中缓缓加入 2 X HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlII1014 Na2HP04,pH 7.1) 约 500 p L, 加入sp2/0细胞培养物中,轻轻摇匀37 °C孵育8h。

再更换为含有 黄瞟岭250 p g/mL、次黄瞟岭15 p g/mL、胸昔10 p g/mL、 氨基蝶岭2 p g/mL、霉盼酸25问/mL的DhEM培养基，37 C cq 孵箱中选择性培养一周后更换为含 250 p g/mL 黄瞟岭的 D; 旧 M 培养基 , 继续培养 2 周以上 , 检查 IFN-P 活性3.IFN- Y的表达以鼠干扰素MulFN- 丫为例（图12-3）用含人 IFN- Y编码区基因的探针与噬菌体Y MG9构建的鼠M600基因组DNA 文库在 20% 甲酷胶中进行低严格性的杂交 , 膜用 0.3molANaCl 、 0.03II1014 拧棱酸纳及 0.1%NaEbS04 在室温洗涤两次将结合的噬 菌体用噬菌斑法纯化 , 提取 DNA 后 , 用多种限制性内切酶切 , 以 1%葡聚糖凝胶电泳纯化后与人CDNA探针杂交，将Y MG9中与探针 可以杂交的 10.5kb 的 BamH I 片段亚克隆到 pBR322 的 BaIIIH I 位 点 , 产生质粒 pMG10.5 通过电泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即 含有完整 MuIFN-Y 的质粒 , 用 PvuII 酶切 , 六个切点中有一个位 于 5' 端非编码区 , 取从此切点到第一内元中 Cla I 的 348bp 的片 段以及用 Cla I 及 Bgl H 酶切得的 MuIFNm Y 3F 端片段 O 将载体 质粒 p342E 用 EcoRI 及 BamHI 酶切 , 并用聚合酶 I 将 EcoRI 切 点补成平头末端 , 与以上制得的两个片段混合 , 一同转化大肠杆菌 294, 选出 AIIIP 抗性菌株 , 从中提取质粒即为含有干扰素编码基因 的 pSVEII111 Y 。

用表面活性剂右旋糖所活化 COEL1 细胞 , 将质粒 转入并培养 48h 后离心 , 上清液中便含有干扰素4. 嵌合干扰素的表达嵌合干扰素大致可以分为两种类型 : 一种是两 种不同类型或同类型。