GPXAPXCATSODAsAGSHMDAProline可溶性蛋白可溶性还原糖可溶性总糖测定方法.docx

一、 抗氧化酶活性测定（APX、GPX、SOD、CAT、Pro）参考《在同一提取系统中同时测定5种抗氧化酶活性》1、 注意事项：在本提取系统中同时测定抗坏血酸专一性过氧化物酶（APX）、愈创木酚过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、可溶性蛋白共5个指标；所有操作过程必须在冰浴中完成，降低保护酶活性的损失；称量药品时可稍稍过量2、 提取液及反应准备液配置：以下溶液1-7d内可用，4℃保存1mol/L HCl（100ml）：8.333ml浓HCl定容至100ml750mM（750mmol/L） H2O2（100ml）：7.570mL 30%H2O2定容至100ml500mM H2O2（100ml）：5.0464mL 30%H2O2定容至100ml10mM H2O2（100ml）：2mL 500mM H2O2定容至100ml1）配置500ml提取液所需试剂药品如下：药品用量Tris3.0285gHCl(1mol/L)22.5ml甘油100mlEDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612gAsA（抗坏血酸）0.08806gDTT（二硫苏糖醇）0.07713gGSH（谷胱甘肽）0.15366gMgCl20.50825g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，然后定容至500ml。

2）500mlA液配置所需试剂药品如下：药品用量Tris3.0285gHCl(1mol/L)22.5ml EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.8，然后定容至500ml3）500mlB液配置所需试剂药品如下：药品用量Tris3.0285gHCl(1mol/L)22.5ml EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，然后定容至500ml3、 GPX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效反应液：111ul愈创木酚用5ml乙醇溶解后加入1ml 500mM H2O2，用B液定容至100ml4、 APX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效反应液：1ml 10mM H2O2用B液定容至100ml；30mM AsA：0.52836gAsA用B液定容至100ml5、 SOD反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效反应液：0.0082gNBT和0.1995g蛋氨酸（甲硫氨酸）用A液定容至100ml0.1mM 核黄素溶液：0.00376gVB2用A液定容至100ml。

6、 CAT反应液配置（100ml）：直接使用B液即可7、 可溶性蛋白反应液：G-250考马斯亮蓝：100mg考马斯亮蓝溶于50ml90%（V/V）乙醇，加入85%（质量浓度）H3PO4100ml，再用蒸馏水定容至1000ml，常温下保存1个月8、 样品提取用长镊子取小麦整株地上部位迅速固定成长2-3cm的棒状并放入液氮中，直至取样过程结束后带回实验室-80℃下贮藏提取时，从液氮中取出样品，待液氮挥发干净后迅速称量然后放入预冷的研钵中磨碎后加入5ml提取液进一步充分研磨至匀浆，转移至10ml具塞刻度试管中，并分2次冲洗，3000r/min离心15min后上清液定容至10ml，取2ml离心管（每个重复2个）加入2ml上清液后12000r/min、4℃离心20min，4℃保存（2天内有效）取上清液作为酶提取液9、 酶活性测定：加入启动液摇匀后应立即放入分光光度计中进行测量1) GPX酶活性：2.95ml 25℃预热后的反应液+50ul（自己摸索）酶液启动反应，测定OD470；每隔30s读数一次，共测量180s，计算增加值每个样品重复2次2) CAT酶活性：2.9ml 25℃预热后的反应液（B液）+50ul酶液（自己摸索）+50ul750mM H2O2启动反应，测定OD240，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算减少值。

每个样品重复2次3) APX酶活性：2.9ml 25℃预热后的反应液+50ul酶液（自己摸索）+50ul AsA(30mM)启动反应，测定OD290，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算减小值每个样品重复2次4) SOD酶活性：1个暗中对照：2.9ml反应液+100ul核黄素；2个光下对照：2.9ml反应液+100ul核黄素；反应液2.85ml+50ul酶液（酶液量需要自己探索）+100ul核黄素，光下放置10~30min（时间如何确定：加入酶液的试管颜色深度是光下对照的一半左右为止；时间必须记录下来，结果中需要用到反应时间），光照强度12000lx，以暗中对照调零，OD560每个样品重复3次5) Pro(可溶性蛋白)含量测定：反应液2.95ml+50ul酶液，25℃反应5min，测定OD595，每个样品重复3次10、结果计算(1) SOD酶活性计算，以抑制光化还原50%所需酶量为1个酶活单位(U)，公式如下：SOD酶活性=[VT×(ODck-ODE)]/[ 0.5×ODck×Vt×W]VT、Vt分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ODck、ODE代表光下对照的分光光度计值和样品管的分光光度计值。

2) APX、GPX、SOD、CAT酶活性计算，以每分钟降低0.1OD值为一个酶活性单位（U），公式如下：酶活性：=( VT×ΔODE)/(Vt×t×W×0.1)VT、Vt分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ΔODE为测定时OD值的改变量，t为OD值变化所花费的时间二、 GSH（谷光甘肽）、AsA（抗坏血酸）、MDA（丙二醛）含量测定1. 提取液、反应液及缓冲液配制：500ml 5%的三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸用蒸馏水定容至500ml；200ml 10%的三氯乙酸：20g三氯乙酸用蒸馏水定容至200ml；200ml 44%的H3PO4：103.5ml浓磷酸（85%）用蒸馏水定容至200ml；500ml 150mM Na2HPO4(pH=7.7)：26.8605g Na2HPO4加入400ml蒸馏水溶解后调节pH，再用蒸馏水定容至500ml；200ml 150mM NaH2PO4(pH=7.4)：4.6805g NaH2PO4加入180ml蒸馏水溶解后调节pH，再用蒸馏水定容至200ml；100ml 100mM 磷酸缓冲液（PBS, pH=6.8）：1.7907g Na2HPO4+0.6805g KH2PO4用90ml蒸馏水溶解后调节pH，再定容至100ml；100ml 3%的FeCl3：3g FeCl3用蒸馏水溶解后定容至100ml。

10ml 4%的2,2-二联吡啶：0.4g 2,2-二联吡啶加5ml乙醇溶解后用蒸馏水定容至10ml；100ml 0.6%的硫代巴比妥酸：用5%的TCA加热溶解并用其定容至100ml注：以上试剂常温下可放置一周TDNB试剂：25.1mg TDNB用pH6.8的磷酸缓冲液定容至10ml（用具塞刻度试管即可），现用现配，4℃保存2. 实验步骤：(1) 提取：取样后迅速用液氮冰冻，用5ml 5% TCA+少许石英砂充分研磨后，再用5ml 5% TCA冲洗入10ml离心管中，3000r/min离心15min，上清液定容至10ml，再吸取定容后的样液各1.5ml放入离心管中用于GSH和AsA含量的测定，剩下的样液用于MDA含量的测定2) MDA含量测定：取4ml样品提取液+4ml 0.6%硫代巴比妥酸，沸水浴10min后离心取上清液定容至8ml，测量其在450nm、532nm、620nm下的OD值，每个样品测量三次3) GSH含量测定：300ul 5% TCA+300ul样液+2.4ml H2O+2.8ml pH7.7 Na2HPO4+0.2ml TDNB，30℃保温5min，每个样品重复三次，测定OD412，调零管中的TDNB用0.2ml pH6.8的磷酸缓冲液代替参与上述过程。

4) AsA含量测定：500ul H2O+300ul样液+400ul pH7.4 NaH2PO4,37℃保温30s后再分别加入800ul 10% TCA、44%H3PO4和4%二联吡啶，40ul 3% FeCl3，然后37℃反应60min，测定OD525,三次重复，调零管加入300ul 5% TCA代替样品提取液参与上述过程3. 结果计算：MDA（umol∙gFW-1）=8×[6.45×(OD532—OD600)-0.56×OD450]×2.5/(1000×W)通过标准曲线查出对应OD值的GSH和AsA含量，按照下式计算GSH和AsA含量GSH(mg∙gFW-1)=C×VT/(Vt×W)AsA(ug∙gFW-1)=C×VT/(Vt×W)VT、Vt分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量三、 可溶性总糖、可溶性还原糖含量测定1. 试剂配制：500ml硫酸-蒽酮溶液：1g蒽酮+5g硫脲用体积比为76：24（硫酸：水）的浓硫酸溶解，4℃保存可用半个月；200ml 2mol/LNaOH：16g NaOH溶解后定容至200ml，用塑料瓶盛放；3,5-二硝基水杨酸：1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20ml 2mol/L NaOH(加热溶解)加入40ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500ml，转移至试剂瓶中，盖好瓶塞，防止CO2进入；2. 实验步骤：(1) 提取：从液氮中取出称重后，用3ml蒸馏水研磨至10ml玻璃试管中，再用4ml冲洗两次，煮沸20min，转移至离心管中（用3ml蒸馏水冲洗两次），调平后3000r/min离心15min，上清液定容至25ml；(2) 还原糖含量测定：2ml 3,5-二硝基水杨酸+2ml 提取液+4ml 蒸馏水，沸水浴5min，调零管用水代替提取液，测定OD540。

3) 总糖含量测定：2.9ml硫酸-蒽酮溶液+100ul提取液，沸水浴10min，对照加水调零，测定OD6203. 结果计算：糖含量=C×VT/(Vt×W)C是根据标准曲线对应OD值查出的糖含量，VT、Vt分别是提取液总体积和参与反应的提取液体积，W是样品质量四、 脯氨酸含量测定1. 试剂配制：500ml 2mol/L的磷酸：67.57ml 85% H3PO4蒸馏水定容至500ml; 100ml酸性茚三酮试剂：2.5g茚三酮+60ml冰乙酸+40ml 2mol/L的磷酸，70℃加热溶解；100ml 3%磺基水杨酸：3g 5-磺基水杨酸用蒸馏水溶解后定容至100ml；2. 实验步骤：(1) 提取：取样称量后用3ml 3%磺基水杨酸研磨，4ml冲洗再次至玻璃试管中，沸水浴15min(加盖)，转移至10ml离心管中，1ml冲洗一次，3000r/min离心15min，上清液定容至10ml；(2) 2ml提取液+2ml冰乙酸+2ml茚三酮，加盖后沸水浴30min；加4ml甲苯摇匀萃取后离心15min，取甲苯层，以甲苯调零，测定OD520，每个样品重复三次3. 结果计算：糖含量=C×VT/(Vt×W)C是根据标准曲线对应OD值查出的糖含量，VT、Vt分别是提取液总体积和参与反应的提取液体积，W是样品质量。