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NMR方法解析蛋白质结构冯银刚北京核磁共振中心()北京大学化学与分子工程学院fyg@yingangfeng@2006.4.12蛋白质结构层次n氨基酸通过肽键形成的生物高分子n一级结构、二级结构、三级结构、四级结构•肽键具有双键性质而不能任意旋转•主链可旋转的二面角，20种常见的氨基酸残基通常NMR中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子核磁共振方法解析蛋白质溶液结构n测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，得到空间结构模型n化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构）适用范围——分子量n分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加）n同核二维1H谱：<80氨基酸n异核多维（二维、三维）：¨常规三共振（1H,15N,13C） <200氨基酸¨氘标记，特殊标记 已报道有700氨基酸n同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备n标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备常规样品n浓度：毫摩尔每升¨ 500uL 10kDa  5毫克每样品n均一n没有聚合n水溶液（10%重水锁场） pH<7.5¨常用缓冲体系：Tris-HCl, 磷酸盐，醋酸盐n稳定性：室温下大于一周¨NaN3¨蛋白酶抑制剂主链主链HN侧链侧链HN芳环芳环HA脂肪族氨基酸侧链脂肪族氨基酸侧链甲基甲基H2ODSSDTT蛋白质的一维谱同核方法n指认方法不同：2D 1H-1Hn两种样品：H2O, D2On实验 TOCSY, COSY, NOESYn自旋系统指认，序列指认n指纹区：HN-HA每个残基一个峰同核方法指认基于相邻序列间的NOE三共振方法—以杨树谷氧还蛋白C1为例实验之前——蛋白质基本性质n杨树谷氧还蛋白C1 (Grx-C1)¨分子量：117个氨基酸残基，12.5kDa¨等电点：8.49¨同源性：~35%¨功能：谷胱甘肽依赖的氧化还原酶¨稳定、无聚合MASKQELDAALKKAKELASSAPVVVFSKTYCGYCNRVKQLLTQVGASYKVVELDELSDGSQLQSALAHWTGRGTVPNVFIGGKQIGGCDTVVEKHQRNELLPLLQDAAATAKNPAQL样品制备——分子生物学方法n基因克隆：cDNA质粒载体n蛋白质表达纯化¨大肠杆菌E. coli BL21(DE3)¨离子交换色谱，凝胶过滤¨纯度：SDS-PAGE 电泳上为单一条带n同位素标记¨使用M9培养基：无机盐，葡萄糖¨15N NH4Cl, 13C 葡萄糖n样品¨~1mM 蛋白质¨磷酸钾缓冲液，pH6.4 ， 90%H2O/10%D2O¨ 0.01% DSS （化学位移校准）¨40mM DTT，0.01% NaN3，蛋白酶抑制剂数据采集n谱仪¨Bruker 500MHz, 600MHz¨三共振探头n采集用于解析一个蛋白质所需要的全部谱图时间约1~2月数据处理n处理的内容： 线性预测－加窗函数－充零－傅立叶变换－相位校正－基线校正n与离线处理¨二维谱：每个约几兆¨三维谱：每个几十兆到几百兆¨nmrPipen多维谱的处理：每一维都要分别进行傅立叶变换化学位移校准n重要性n1H使用 DSS (2,2-dimethylsilapentane-5-sulfonic acid sodium salt)n异核：间接校准¨以DSS的0 ppm处的频率乘以换算因子得到异核的0 ppm的频率NMR初步鉴定n蛋白质折叠程度H2ODSSDTTNMR初步鉴定n1H-15N HSQC¨分散程度：折叠程度¨确定谱宽¨指认基础：每个氨基酸（除脯氨酸外）都在HSQC上有一个峰三维实验（双共振、三共振）n减少谱峰堆积n利用异核之间较大的耦合常数n基于J耦合进行共振指认，减少对空间构象的依赖三维实验n绝大多数异核多维实验可以类比于二维COSY, TOCSY, NOESY及其组合n主链指认实验n侧链指认实验nNOE实验1 2 3HN---NH---Ca(i,i-1)HNCaNH化学位移指认n化学位移：每个原子的身份证n主链指认¨序列连接¨氨基酸类型判断主链指认nHNCACB-CBCA(CO)NH化学位移指认n侧链指认¨3D TOCSY或 COSYnH(C)CH-TOCSY¨芳环 (HB)CB(CGCD)HD (HB)CB(CGCDCE)HE n通过NOE确认指认¨主链¨侧链用于Grx-C1指认的实验n主链指认：2D 1H-15N HSQC, 3D HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO ~10天n侧链指认：2D 1H-13C HSQC, 3D HBHA(CBCA)(CO)NH, (H)C(CO)NH, H(C)(CO)NH, 1H-15N TOCSY-HSQC HCCH-TOCSY, CCH-TOCSY, HCCH-COSY, CCH-COSY, 2D (HB)CB(CGCD)HD, (HB)CB(CGCDCE)HE ~20天nNOE：3D 15N NOESY-HSQC, 13C NOESY-HSQC(for aliphatic region), 13C NOESY-HSQC(for aromatic region) ~10天Grx-C1指认结果n1H,15N,13C指认率：>98%n1H-15N HSQC 上所有谱峰得到了指认nJ. Biomol. NMR 2005, 31:263-264nBMRB 6410 http://www.bmrb.wisc.edu由化学位移得到二级结构的信息n二级结构¨CSI：化学位移与无规卷曲的多肽化学位移之差¨TALOS：基于数据库比对预测二面角¨可用于结构计算和分析结构计算n基本方法¨由实验得到各种构象约束信息：距离，二面角n约束信息是不完备的n约束信息是不精确的¨计算满足这些约束条件的构象n距离几何(Distance Geometry)n约束条件下的分子动力学模拟(Restrained Molecular Dynamics Simulation)约束信息n距离约束¨1H-1H NOE¨氢键n二面角约束¨主链¨侧链¨肽键：反式－顺式n其他¨手性 L-氨基酸约束生成nNOE¨指认nUnique：只有一种可能nAmbiguous：有多种可能¨转化为距离n实验通常可检测 <5Å n距离是不精确的：距离范围n距离是大量的精确结构•其中一种可能是正确的•多种可能都是正确的（谱峰重叠）二面角约束Øa a-helix: f f = -100 to -20,   = -70 to -10Øb b-sheet: f f = -180 to -60,   = 20 to 180n二面角¨预测：CSI或TALOS¨实验：HNHA,HNHB等n ,  对特定的二级结构有一定的分布n拉氏图(Ramachandran plot)¨最佳区¨次佳区¨一般区¨不允许区二面角约束n二级结构判断：特征的NOE信号氢键约束α-HelixParallel β-StrandsAnti-parallel β-StrandsH----O 2.0Å N----O 3.0Å N-H - - - - O•根据二级结构或实验判断氢键分子动力学模拟（结构计算）n模拟分子随机运动，使其达到能量的最小值n约束条件转化为MD中的能量项Vtotal= Vbond+ Vangle+ Vdihedr+ Vvdw+ Vcoulomb+ VNMRn模拟退火：克服局部的能量最小点n计算多个结构，取能量较低的若干结构作为结果Ensemble (NMR信息的不完备和不精确)KNOE(rij-rij1)2 if rijriju0 if rijl

违约产生原因是约束中存在错误，造成约束之间或约束和化学结构之间存在矛盾结构评价n能量n二级结构n拉氏图¨尽可能少的氨基酸残基处于不允许区nRMSD（均方根偏差）¨表明结构的收敛程度自动化结构计算nNOE自动指认¨CANDID/CYANAn只需提供指认的化学位移列表和NOE谱峰列表n自动进行NOE指认n自动通过7个结构计算循环（100个结构取二十个），逐步优化指认结果n自动计算结果正确性依赖于原子化学位移指认的比例和正确性 （至少>90%）¨SANEn依赖初始结构的自动NOE指认Grx-C1的结构计算nCYANA 结构初步优化¨力场相对简单¨运行速度快¨无需初始结构¨结构相对较为粗略nAmber 结构精修¨具有更精细的力场参数，使用溶剂化模型（或显式加溶剂）从而获得更加合理的局部构象¨需要整体折叠正确的初始结构¨运算量大，速度慢Grx-C1的结构计算nCANDID/CYANA得到初始结构（全自动）¨2 CPU, ~8小时nSANE-CYANA循环，进行初步优化（半自动）¨手工分析违约和未指认的NOE¨每个循环 2CPU ～1小时¨～20-40个循环nSANE-AMBER循环，进行结构精修（半自动）¨每个循环 20 CPU ～15小时¨～10~30个循环结构计算结果nPDB 1Z7P(ensemble), 1Z7R(mean) http://www.rcsb.org/pdb结构计算结果n约束统计¨NOE： 4845¨二面角：160¨氢键：47¨手性：287n违约状况¨距离 无>0.2Å ¨二面角 无结构计算结果n结构评价Most favored regions (%)88.8Additionally allowed regions (%)10.7Generously allowed regions (%)0.5Disallowed regions (%)0.0RMSDAll residues Regular secondary structureBackbone heavy atoms0.880.32All heavy atoms1.130.68三共振方法所需时间n提取样品——2～4周n数据采集——4～8周n数据处理——1～4小时每实验n共振指认——2～4周n结构计算——2～4周¨数据处理通常在数据采集后立即进行，在总时间中可忽略不计¨数据采集与共振指认的时间可部分重叠一些其他因素n水峰压制n小分子干扰¨对异核实验影响不大n温度：控温装置n分辨率、信噪比与时间¨分辨率：间接维点数¨实验时间与间接维点数成正比¨信噪比与累加次数的平方根成正比¨实验时间与累加次数成正比最新的进展n谱仪：超低温探头¨提高灵敏度2－4倍nTROSY（横向弛豫优化谱）¨在700MHz以上高场谱仪中可以显著减小线宽，从而可用于测定更大分子量的蛋白质nRDC（残余偶极耦合）¨得到化学键的空间相对取向信息n自动化方法¨显著加速结构计算进程使用的软件nNMRPipe 数据处理http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/NMRPipe/nNMRView 指认分析 500 Euro http://www.las.jp/prod/cyana/eg/nTALOS基于化学位移预测主链二面角 (NMRPipe的一部分)http://spin.niddk.nih.gov/NMRPipe/talos/nSANE基于结构的NOE自动指认J Biomol NMR, 2001 19(4) 321-9 nAmber 分子动力学模拟。

用于结构优化 $400 http://amber.scripps.edu/ nPROCHECK-NMR 结构分析与评价http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck_nmr/procheck_nmr.htmlnMOLMOL 结构分析与绘图http://hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/其他软件n数据处理¨Felix $???? Free http://www.bio.cam.ac.uk/azara/¨PROSA (Free?) http://guentert.gsc.riken.go.jp/Software/Prosa.htmln指认分析¨Felix $???? $ 200 http://hugin.ethz.ch/wuthrich/software/xeasy/index.html¨Sparky Free http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/¨CARA Free http://www.nmr.chn结构计算¨CNS Free http://cns.csb.yale.edu/¨XPLOR Free http://xplor.csb.yale.edu/xplor/¨XPLOR-NIH Free http://nmr.cit.nih.gov/xplor-nih/n分子绘图¨PyMol Free Free http://www.avatar.se/molscript/¨RasMol Free http://www.openrasmol.org/¨VMD Free http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/NMR结构解析流程生物信息学和生物化学分析样品制备（蛋白质表达纯化，标记）核磁共振数据收集化学位移指认NOE指认结构计算核磁共振初步鉴定二级结构分析参考书nNMR of Proteins and Nucleic Acids, Wuthrich K., Wiley Press, 1986 nNMR of Macromolecules, Roberts J., Oxford University Press, 1993 nProtein NMR Techniques, Ed. David G. Reid, Humana Press,1997 (Methods in Molecular Biology, V60) n蛋白质分子的溶液三维结构测定——多维核磁共振方法，华庆新，湖南师范大学出版社，1995 n现代核磁共振实用技术及应用，毛希安著，科学技术文献出版社，1999 n生物大分子多维核磁共振，夏佑林等，中国科学技术大学出版社,1999 。