花青素的分离提纯测定实验具体方案.docx

花青素的提取、测定仪器材料试剂：仪器：旋转蒸发仪，真空泵，分光光度计，真空干燥箱，水浴锅，天平 材料：新鲜的紫葡萄和青葡萄试剂：无水乙醇，盐酸，铁氰化钾，三氯乙酸，硫酸亚铁实验步骤一、花青素的提取：1、 挑选新鲜的紫葡萄薄洗净晾干，分离出果肉、果皮、籽粒2、 将分离晾干的紫色葡萄果皮，80°C下干燥1h3、 称取2g磨成粉末4、 用含有1%盐酸的乙醇溶液浸提2次，合并提取液5、 讲合并提取液进行抽滤6、 60C减压浓缩7、 真空干燥8、 得粗提取液二、提取条件的优化:水平A提取温度/CB乙醇浓度/%C提取时间/min505060D料液比/(g/ml)1:1060706070901201:201:30实验序号ABCD结果111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3Q确定最佳提取方案然后对果皮、果肉、籽粒进行提取，测定最佳提取部位三、 纯化纸层析法提纯1. 取准备好的滤纸条（2X20cm）,将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽 约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方折叠出一条直线，作为画滤液细线的基准线2. 用毛细吸管沾少许滤液在折线上描绘4~5次，注意要画得匀、直、细，每次 画完细线要等其自然变干后再画第二根线。

3. 在大试管中加入常用的展开剂有V（丁醇）：V（乙酸）：V（水）=4 ： 1 ： 5,V（正丁 醇）:V（2mol/LHCl）=1 : 1,V（乙酸）:V（浓 HCl） : V（水）=15 : 3 : 82,1%盐 酸,V（浓HCl） : V（水）=3： 97等（即层析液）然后将滤纸条固定于软木塞上，插 入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁）， 盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析4. 展开后剪下色斑，以酸化甲（乙）醇洗涤、浓缩，即可得到样品四、 花青素的测定1.采用普鲁士蓝法测定花青素的还原能力取一定浓度的样品溶液1 mL，加入磷酸盐缓冲液和1%K3Fe （CN） 6各2.5 mL，混 合均匀，混合液50 °C保温20 min，快速冷却，加入10 %的三氯乙酸溶液2.5 mL， 离心10 min取上清液2.5 mL，加入等量蒸馏水和0.1%的FeCl3 1mL，摇匀，10min 后700nm下测定吸光值A700，以抗坏血酸为对照2青素清除体外自由基能力测定利用Fen ton反应产生羟自由基［6］取2 mL PBS （磷酸盐缓冲液pH=7.4），依次 加入20mmol/L EDTA和12mmol/L FeSO4混合溶液0.1mL，—定浓度的花青素溶液1 mL、100mmol/LH2O2 0.1mL，用磷酸盐缓冲液定容至5 mL，迅速混匀，置于37 C 水浴15 min。

测定510nm下光吸收值，计算清除率清除率二（对照吸光度-样品 吸光度）/对照吸光度X100%。