细胞生长状况有关指标的检测方法.doc

细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一所用材料为细胞计数板巴氏吸管和显微镜步骤如下l　 　 　 　 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干l　 　 　 　 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡l　 　 　 　 在显微镜下用10X 物镜观察计数四角大方格中的细胞数代入下式得出细胞密度细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色此外还可用0.02%的藻红 b 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100%在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h 取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天） ，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线也可采用 MTT 法来进行生长曲线测定　 　 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经1个生长周期达到最大活细胞浓度比例生长倍数=培养后最大活细胞数浓度/接种时的活细胞浓度三、细胞分裂指数细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标它以被测的1000个细胞中的分裂细胞数来计算其方法为：用秋水仙素将细胞处理1-2h 后，玩染色制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂象的数目，重复4次取平均值，用百分比表示l　 　 　 　 细胞准备用支持物盖片培养法l　 　 　 　 每24h 取出一个小盖片，按常规方法进行固定，吉姆萨染色或 HE 染色，封片，制成永久标本。

l　 　 　 　 显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数逐个视野进行，对每一时间组的盖片各取细胞多、中、少的区域各一个，共计算1000个细胞，计算出平均分裂细胞所占百分比观察时要掌握好分裂象标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差细胞分裂指数=分裂细胞数/细胞总数（1000）×1000[next]四、细胞接种存活率细胞接种存活率又称细胞贴壁率它是下拨被制成分散的悬液后，以低浓度（2-5个/cm2）接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力l　 　 　 　 取对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶中，接种12-15瓶l　 　 　 　 每2h 取出一瓶，倒掉培养科，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面的公式逐个计算每个时间上的贴壁率每2h 一次，共观察24h 即12次接种存活率（贴壁率）=（贴壁村活细胞数/接种细胞数）X 100%五、克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。

而形成克隆的细胞必为贴壁和有增值活力的细胞克隆形成率反映细胞群体依赖性和增值能力两个重要性状，由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率低，传代细胞系高；二倍体细胞克隆形成率低，转化细胞系高；正常细胞克隆形成率低，肿瘤细胞高并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在皿中，持续1周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养1、平板克隆形成试验l　 　 　 　 取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的 RPMI 培养基中备用l　 　 　 　 将细胞悬液做梯度倍数稀释，以适当的细胞浓度接种于培养皿中一般按每皿50个、100个、200个细胞的梯度密度接种于含10ml 37℃预温培养基的皿中，并轻转动，使细胞分散均匀置于37℃、5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2-3周l　 　 　 　 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清，用 PBS 小心浸洗2次加纯甲醇或醋酸/甲醇（1：3）5ml，固定15min然后去固定液，加适量吉姆萨应用染液染10-30min，然后用流水缓慢洗去染液，空气干燥。

l　 　 　 　 将培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜下计数大于10个细胞的克隆最后计算克隆形成率克隆形成率=（克隆数/接种细胞）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞适宜底物为玻璃的、塑料的瓶试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大2、软琼脂培养克隆形成试验l　 　 　 　 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的 DMEM 培养基调整细胞密度至1X10^6个/L然后根据试验要求做梯度倍数稀释l　 　 　 　 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点软琼脂，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固l　 　 　 　 按1：1比例让1.2%的琼脂糖液和2XDMEM 培养基混合后，取3ml 混合液注入直径6cm 平皿中，冷却凝固作为底层琼脂，置 CO2恒温箱中备用l　 　 　 　 按1：1比例让0.7%琼脂糖液和2XDMEM 培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml 细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层的平皿中，逐渐形成双琼脂层。

待上层琼脂凝固后，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养10-14天l　 　 　 　 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计算克隆形成率软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞系和转化细胞系试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃接种细胞密度每平方厘米不超过35个，一般6cm 平皿接种1000个细胞正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。