清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定.doc.docx

幽香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分别鉴定芽孢杆菌是大曲中常见微生物， 也是重要类群之一； 地衣芽孢杆菌始终以来被认为是酱香型白酒高温大曲中特有的微生物， 就我们争论发觉， 在牛栏山酒厂生产用的多种幽香大曲、出池酒醅中同样存在地衣芽孢杆菌，对分别出 23 株芽孢杆菌进行生理生化试验，鉴定出 12 株地衣芽孢杆菌，鉴定结果与中国食品发酵工业争论院分子鉴定结果一样； 本文主要介绍地衣芽孢杆菌的生理生化鉴定试验方法，为地衣芽孢杆菌的鉴定供应比较完备的一套方法；1 地衣芽孢杆菌的分别1.1 材料牛栏山酒厂生产用幽香大曲、酿酒车间酒醅1.2 分别用培育基肉汁培育基： 牛肉膏 0.3 ％，蛋白胨 1.0 ％，NaCl 0.5 ％，琼脂 2.0 ％，pH7.0-7.2 ，121℃，灭菌 30min；1.3 分别方法取大曲干粉或酒醅 0.5g ，加入带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇床培育 30min， 60℃水浴 30min，然后用接种环蘸取，在肉汁培育基平板上划线分别；挑取单菌落连续划线分别，直到得到单菌落纯菌株为止；2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定试验依据上述分别培育基和分别方法，共计分别得到芽孢杆菌 23 株，编号分别为 1＃、2＃、3＃、4＃ 22＃、23＃，接下来通过试验对这些菌株进行挑选和鉴 定；地衣芽孢杆菌鉴定参考 《伯杰氏细菌鉴定手册》 及《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英等编著）的方法，有所改进，以下为详细的生理生化试验鉴定方法；2.1 柠檬酸盐与丙酸盐利用试验某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯独碳源， 并利用磷酸铵作为氮源， 将柠檬酸分解为二氧化碳， 就培育基中由于有游离钠离子存在而呈碱性； 培育基配方：柠檬酸钠（或丙酸钠）0.2 ％，NaC10.5 ％，MgSO.47H2O0.01 ％，〔NH4〕2HPO40.1 ％， K2HPO.4 3H2O0.1 ％， 1%溴百里酚蓝水溶液 10ml，琼脂 2％；以上成分除指示剂 外其余加热溶解，调剂 pH＝6.8-7.0 ，并加入指示剂，使培育基呈草绿色，分装 试管，灭菌后摆斜面；取幼龄菌种接种于斜面上，适温培育 3-7d ，培育基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者为阴性；只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸钠，为阳性反应，而其他芽 孢杆菌均不能利用丙酸钠， 为阴性反应，但许多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠；2.2 产酶试验2.2.1 过氧化氢酶试验过氧化氢酶又称接触酶， 能催化过氧化氢分解水和氧； 将芽孢杆菌接种于肉汁培育基斜面上，适温培育 18-24h ；取洁净的载玻片，在上面滴 1 滴 3-5 ％的 H2O2，挑取 1 环培育 18-24h 的菌苔，在 H2O2溶液中涂抹，如有气泡（氧气）显现，就为过氧化氢酶阳性， 无气泡者为阴性；也可将过氧化氢溶液直接加到菌种斜面上， 观看气泡的产生；12.2.2 淀粉酶试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶， 把淀粉水解为无色糊精等小分子， 或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖；淀粉水解后，遇碘不变蓝色；培育基：在肉汤蛋白胨琼脂中添加 0.2 ％的可溶性淀粉，分装三角瓶， 121℃20min 灭菌备用；卢戈氏 〔Lugol〕 碘液：碘片 1g，碘化钾 2g，蒸馏水 300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容；将灭菌后放入培育基冷却到 50℃左右，倒成平板，凝固后，取 18-24h 的纯培育物点于平板上，每皿可点种 3-5 个菌株，适温培育 2-4d ，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液， 以铺满菌落四周为度， 平板成蓝色； 假如菌落四周有无色透亮圈显现，说明淀粉已经被水解，试验为阳性，否就为阴性；透亮圈的大小一般 说明水解淀粉的才能；2.2.3 纤维素酶试验采纳刚果红染色法， 假如有刚果红存在， 刚果红可以与纤维素结合成红色螯合物， 培育基颜色为红色； 假如培育基中有能够产纤维素酶的细菌， 将纤维素分解， 不能形成螯合物，在菌落四周形成透亮圈；这样可以鉴定产纤维素酶的细菌；培育基的配制： CMC-Na 5-10g，酵母膏 1g ，KH2PO4 0.25g，琼脂 15g，将上述物质溶解后 , 用蒸馏水定容到 1000ml，加入 5ml 10mg/ml 的刚果红溶液， 121℃， 灭菌 20min，冷却倒平板，凝固后待用；取 18-24h 的培育物点于平板上，每皿 可点种 3-5 个菌株，适温培育 2-4d ，形成菌落后，观看产生透亮圈情形，产生纤维素酶的菌落四周将会显现明显的透亮圈，否就为阴性；2.2.4 明胶液化试验明胶是一种动物性蛋白， 明胶的水解是由于有些细菌具有明胶酶 （亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽， 又进一步水解为氨基酸， 失去凝胶性质而液化；明胶培育基本身低于 20℃凝固，高于 24℃就自行液化；明胶分解后，其分子变 小，虽在低于 20℃的温度下也不再凝固；培育基：蛋白胨 5g，明胶 120g，蒸馏水 1000ml，调剂 pH7.2-7.4 ，分装试管，培育基高度约 4-5cm， 115℃ 20min 灭菌；挑取 18-24h 培育物，以穿刺法接种于试管中心，于 20-22 ℃培育；每天观看结果，液化为阳性，否就为阴性；2.3 需厌氧试验在培育基中加入仍原剂， 如巯基醋酸钠和甲醛合次硫酸钠等， 以除去培育基中的氧气或氧化型物质，使厌氧菌能在有氧情形下生长；培育基：酪素水解物 20g，NaC15g，巯基醋酸钠 HS. CH2COON2ag，甲醛合次硫酸钠 HOCH.2 SO2Na1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000ml，调剂 pH 7.2 ，分装试管 121℃灭菌 20min，培育基不摆斜面；用 1 环肉汤菌液，穿刺接种到上述培育基中，必需穿刺到管底； 30℃培育 3-7d观看结果；如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌， 如沿着穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌；2.4 乙酰甲基甲醇试验 〔V.P 试验〕某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培育基中能分解葡萄糖产生丙酮酸， 丙酮酸缩合， 脱羧成乙酰甲基甲醇， 后者在强碱环境下， 被氧化为二乙酰， 二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称 V.P 阳性反应；培育基：蛋 [FS:PAGE]白胨 5g，葡萄糖 5g，NaC1 5g，蒸馏水 1000ml；调剂 pH7.0-7.2 ，分装试管，每管约装 4-5ml ，115℃灭菌 20min；试剂： 40％ NaOH（或 KOH），肌酸；2接种于上述培育液中，适温培育 4-6d ；如为阴性，可适当延长培育时间；取培 养液（约 2ml）和等量的 40％NaOH相混合，加少量（约 0.5-1.0mg ）肌酸，充分振荡 2-5min ，如培育液显现红色即为阳性；有时需放置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行；2.5 酪素水解试验牛奶平板的制备：取 5g 脱脂奶粉加入 50ml 蒸馏水中（或用 50ml 脱脂牛奶），取 1.5g 琼脂溶于 50ml 蒸馏水中，将两溶液分开灭菌；待冷至 45-50 ℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板；将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种 点接在平板上，每皿可点接 3-5 个株菌；适温培育 3-5d ，记录菌落四周和下面酪素是否已被分解而呈透亮； 配制该培育基时， 切勿将牛奶和琼脂混合灭菌， 以防牛奶凝固；2.6 酪氨酸水解试验有些细菌具有酪氨酸酶， 能使含酚类的化合物如酪氨酸、 酚等氧化成醌， 再经脱水、聚合等一系列反应，最终形成黑色沉淀物质；培育基：采纳肉汤蛋白胨培育 基加 0.1 ％ L- 酪氨酸，调剂 pH为 7.0 ，分装 121℃灭菌 20min 后摆成斜面；接种后培育 3-7d ，观看斜面有黑色素者为阳性反应；2.7 酸性培育基试验培育基：蛋白胨 10g，葡萄糖 20g，蒸馏水 1000ml，调剂 pH 5.7 ，115℃灭菌 20min；取菌液一环，接种于上述培育基中，同时接种一般肉汤液（ pH7.0 ）作对比；适温培育 1-3d 内观看生长情形；该培育液要求非常澄清， pH必需精确，用 pH计调测；2.8 耐盐性试验耐盐性试验是观看渗透压对细菌生长的影响； 由于不同菌类耐盐性不同， 故常以此作为鉴别特点； 一般可依据不同种类的菌株， 挑选其适合生长的培育基， 在其中加入不同量的 NaCl，接种后观看其生长与否，以判定其耐盐性；依据鉴定需要， 以肉汤培育液配成不同浓度 NaCl 溶液， 如 2％、5％、7％、10％等；培育基要求非常澄清，接种时应采纳幼龄菌液接种，适温培育 3-7d ，与未接种的对比管对比，目测生长情形；2.9 生长温度试验细菌生长的最高、最适、最低温度，经常是某些细菌鉴定的特点之一；测定细菌 的生长温度，要求培育液非常澄清（如养分肉汁培育基），并采纳液体菌种直接 接种，放置于恒温水浴培育；在指定温度下培育 2-5d ，观看生长情形；如在接近 0℃的低温培育，就观看时间可延长 7-10d 或更长；培育 5d 能生长者按生长运算，否就按不生长运算，可疑者需重新进行培育试验；2.10 产酱香试验地衣芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的一个重要作用就是产生酱香物质， 这与其产生蛋白酶类有关， 蛋白酶将蛋白质分解成肽类和氨基酸， 经过发酵会产生酱香物质；本试验采纳三种培育基鉴定地衣芽孢杆菌是否产生酱香物质；甘氨酸培育基：甘氨酸 5g，葡萄糖 10g，NaCl 3g，蒸馏水 1000ml，pH 6-7 ，分装 50ml 到 100ml 三角瓶中， 121℃灭菌 20min；养分肉汁培育基：牛肉膏 3g，蛋 白胨 10g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.4 ，分装 50ml 到 100ml 三角瓶中， 121℃灭菌 30min；以上两种培育基均为液体培育基，取培育 18-24h 菌种接入到液体培育基中，摇床 37℃培育 48-60h ，取出，鉴定是否产生酱香物质；3麸皮培育基： 麸皮 1000g，NaOH6g，蒸馏水 600ml，分装到 500ml 三角瓶中，121℃ 灭菌 40min；接入液体培育菌种 10％，恒温箱培育 3-5d ，取出，鉴定是否产生酱香物质；2.11 糖发酵试验糖发酵试验主要是看该种糖能不能被微生物利用，假如能够利用就会发酵产酸， 培育基中的指示剂会由紫色变黄色， 同时可能伴有气泡产生， 假如发酵产气就试管中倒扣的杜氏管中培育基会被排出， 里面布满气体； 本试验中糖发酵试验选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖等；培育基配方为： 〔NH4〕2HPO4 1g， MgSO.4 7H2O 0.2[FS:PAGE]g，KC1 0.2g ，酵母膏 0.2g ，糖或醇类 10g，蒸馏水 1000ml，0.04 ％溴甲酚紫乙醇溶液 20ml，调剂 pH7.0-7.2 ，分装试管，每管装 10ml 培育基，试管内放有杜氏发酵管， 115℃灭菌 20min，排 净杜氏管中的空气；以 18-24h 的幼龄菌种，接种一环到上述培育基中，适温培育 3-5d ，观看指示剂是否由紫色变黄，杜氏管中是否有空气；3 生理生化试验鉴定结果（详细结果见附表 1，2，3）3.1 柠檬酸盐与丙酸盐利用试验结果23 个菌株均可以利用柠檬酸盐，这也与多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠的特征符合；只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸盐， 2＃、5＃、8＃、10＃、13＃、14＃、16＃、17＃、18＃、19＃、21＃、22＃这 12 株均可以利用丙酸盐，可以初步认为这 12 株为地衣芽孢杆菌，仍需要其他的生理生化试验来验证；3.2 淀粉酶试验结果试验的 23 。