crispr原理解析.ppt

CRISPR•CRISPR：是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，实际上就是一种基因编辑器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因•系统分类： Ⅰ Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，Ⅱ类只需要一种Cas蛋白，（CRISPR/Cas9系统最为广泛）•CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成• Leader一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列•Repeat长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开•Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的•crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源DNA（ protospacers ）入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来。

•sgRNA：CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由tracrRNA和crRNA两部分组成, 两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切•Cas： CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas•PAM： （protospacer adjacent motif ）protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域，剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区•工作原理： crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。

而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，引导 Cas9 对 DNA 的定点切割第一阶段：外来DNA采集             宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，使入侵细菌的短片段DNA作为间隔区序列插入到宿主的CRISPR位点第二阶段：CRISPR RNA的生物合成             CRISPR RNA的生物合成从转录开始，接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列）对应的互补序列 pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，这两个RNAs可以融合成一个sgRNA第三阶段：靶向干扰            crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。

数据：•genome-scale￿CRISPR-Cas9￿knockout￿(GeCKO)￿library￿targeting￿18,080￿genes￿with￿64,751￿unique￿guide￿sequences.•The￿GeCKO￿v2￿libraries￿consist￿of￿over￿100,000￿unique￿gRNAs￿for￿gene￿knock-out￿in￿either￿the￿human￿or￿mouse￿genome.￿http://genome-engineering.org/gecko/?page_id=114•敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的人(胚肾细胞株)293T稳定细胞株（广州医科大学）•在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因（麻省理工学院 张峰）          CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA基序（DNA motif）的结合，这个短DNA基序通常在靶DNA的3‘末端发现，被称为前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM） Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）是一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑的核酸内切酶，与Cas9不同，NgAgo–gDNA系统不需要PAM，初步鉴定表明，该系统对导向-靶向（guide–target）错配耐受低，且对编辑富含G+C的基因组更加有效。

据介绍，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes几乎存在于所有的有机体中要想与Cas9正确绑定，导向RNA必须有3′RNA-RNA杂化结构，而与Argonaute绑定不需要导向分子有任何特定的二级结构另一方面，Cas9只能切割PAM上游的序列，而Argonaute不需要靶标有特定的序列 NgAgo有望成为编辑哺乳动物基因组的精准有效的工具。