【最新】DNA凝胶电泳常用试剂配制.doc

DNA 的凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围常用电泳缓冲液缓冲液 使用液 浓储存液（每升）Tris-乙酸（TAE ）1×:0.04mol/L Tris－乙酸0.001mol/L EDTA50×:242g Tris 碱57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/L Tris-磷酸0.002mol/L EDTA10×:108g Tris 碱15.5ml 85％磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE） a0.5×:0.045 mol/L Tris-硼酸0.001mol/L EDTA5×:54g Tris 碱27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液 b1×:50mmol/L NaOH1mmol/L EDTA1×:5ml 10mol/L NaOH2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)a．TBE 浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃以往都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。

但 0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的 1×TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的 2 倍聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1×TBE 以提供足够的缓冲容量b. 碱性电泳缓冲液应现用现配凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v） 〕 线状 DNA 分子的有效分离范围（kb）0.3 5－600.6 1－200.7 0.8－100.9 0.5－71.2 0.4－61.5 0.2－32.0 0.1－2凝胶加样缓冲液缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度Ⅰ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青 FF40%(w/v)蔗糖水溶液4℃Ⅱ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青 FF15％聚蔗糖（Ficoll ） （400型；Pharmacia ）水溶液室温Ⅲ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青 FF30％甘油水溶液4℃Ⅳ 0.25％溴酚蓝40%(w/v)蔗糖水溶液 4℃Ⅴ碱性加样缓冲液300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖（Ficoll） （400 型；Pharmacia）水溶液0.15%溴甲酚绿0.25％二甲苯青 FF4℃使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。

溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关以 0.5×TBE 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同在琼脂糖浓度为 0.5－1.4％的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著选用哪一种加样染料纯属个人喜恶但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明2.聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺〔％（w/v） 〕a有效分离范围（bp） 二甲苯青 FFb 溴酚蓝 b3.5 1000－2000 460 1005.0 80－500 260 658.0 60－400 160 4512.0 40－200 70 2015.0 25－150 60 1520.0 6－100 45 12a. N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的 1/3.b. 给出的数字是迁移率与染料相同的双链 DNA 片断的粗略大小（核苷酸对）30％丙烯酰胺：丙烯酰胺 29gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺 1g加水至 100ml将溶液加热至 37℃使化学药品溶解小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。

丙烯酰胺的作用具有累积性称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具取用含上述化学药品的溶液也要戴手套尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理10％过硫酸铵过硫酸铵 1g加水至 10ml可在 4℃保存数周制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积 100ml）制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的毫升数试剂3.5％ 5.0％ 8.0％ 12.0％ 20.0％30％丙烯酰胺 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6水 67.7 62.7 52.7 39.3 12.75×TBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.010%过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7每 100ml 丙烯酰胺凝胶溶液加 35ulTEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） ，旋动容器混匀。