分子实验14 蛋白质纯化.doc

蛋白质纯化一、亲和层析1、绪论亲和层析是基于待分离物质，如蛋白质、多肽、糖蛋白和核酸等生物分子，与固定化在载体上的配基分子之间的专一性相互作用的一种色谱学方法通常是在载体（无机或有机介质）表面先键合一段间隔臂，再连接上配基间隔臂的作用是减少待纯化蛋白质（或其他生物大分子）与其相适应配基结合时的空间位阻这种固相化的配基将只能与其有生物特异亲和性的蛋白质分子相互作用而吸附，没有这种作用的其他生物分子不被吸附而流出层析柱，然后，改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来，于是达到分离纯化的目的2、材料AKTATM 层析仪，电脑，分部收集器缓冲液贮槽层析柱、HiTrap chelating HP 1ml 和 5ml偶联试剂，Ni 2+洗柱缓冲液 1M NaOH纯化缓冲液 Binding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole6M guanidine hydrochloride, 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Washing Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole6M urea 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Refolding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Elution Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl,500mM imidazole1mM 2-mercaptoethanol pH8.0洗 Ni 缓冲液：20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH7.43、操作步骤（以纯化 N-terminal (His)6-tagged recombinant protein produced in E. Coli 为例1、亲和层析柱连 AKTATM 层析仪2、用 5-10 柱体积的去离子水走柱，去除保存在柱子中的 20%的酒精3、走 0.1M NiSO4 入柱，至层析柱变蓝4、走 10 柱体积的去离子水平衡层析柱5、用 Binding Buffer 平衡层析柱纯化：1、将已准备好的样用 AKTATM 层析仪进柱2、用 10 柱体积的 Binding Buffer 平衡柱子3、走 10 柱体积的 Washing Buffer4、复性：走线性梯度，共 30 柱体积，Washing Buffer 0%→Refolding Buffer 100%5、用 Elution Buffer 将目的蛋白洗脱下来，并收集样品层析柱的再生和保存：1、走 10 柱体积的去离子水去除层析柱中的 Buffer2、走 10 柱体积的洗 NiBuffer 洗掉 Ni 离子3、用 10 柱体积的去离子水平衡4、走 1M NaOH 入层析柱，并浸泡 2h，去除层析柱中沉积的蛋白和其它杂质5、走 10 柱体积的去离子水和 PH 为 7.0 的缓冲液平衡层析柱，直到层析柱中性为止。

6、用 20%的乙醇保存层析柱1、讨论在亲和层析中常出现的一些问题以及解决方法1、注意任何时都不得使层析柱流干或进气泡，并且不要超过树脂所能承受的压力2、避免偶联试剂，缓冲液和乙醇三者混合在一起，易产生沉淀，可用 NaOH浸泡的方法去除3、一般 5-10 次纯化后才用 NaOH 彻底清洗层析柱4、所有上柱的样品和缓冲液都须过 0.2uM 滤膜，防止堵塞二、凝胶过滤层析1、概述凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析原理：凝胶过滤层析是再装填有多孔性材料的色谱柱中进行的，是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量蛋白质更早地被洗脱下来最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此他们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以进入所有填料得孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底2、材料1、 凝胶过滤缓冲液：根据纯化的样品选择2、 部分常见的凝胶过滤色谱填料3、 仪器凝胶过滤层析柱装柱配套用具或凝胶储槽缓冲液储槽AKTA电脑分部收集器3、步骤1．如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。

切勿用磁力搅拌器搅拌让凝胶颗粒自然降对预溶胀的凝胶，先用大量缓冲液洗去防腐剂，重悬于等体积的凝胶缓冲液，倾入细颈过滤瓶中，在使用前进行脱气2． 装柱：装柱前取 3/4 体积的凝胶和 1/4 体积的缓冲液制成凝胶浆先将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口沿柱子一侧或沿一根玻璃棒倾入凝胶浆，必须一次完成，否则柱床不均一当凝胶装到柱底之后，打开柱底出口以加快装柱进程，随之加入更多的缓冲液将层析柱与 AKTA 湘连接，用几倍柱床体积的缓冲液洗涤层析柱，以使其稳定和平衡3． 样品上柱及洗脱（1） 样品应高度浓缩（10-20mg/ml） ，体积应尽量小（适当的上养量为柱床体积的 1%-5%）上样前样品需用 022um 的滤膜过滤2） 样品上柱：层析柱经平衡后，将平衡液流至柱床表面以下 1-2mm 时，关闭出口，用加样气将样品加至柱床表面，并打开出口，使样品渗入胶内样品加完后，用小体积的洗脱液洗表面1-2 次，再连接 AKTA.（3） 洗脱：缓冲液流经层析柱进行洗脱，目的蛋白洗出时收集4） 层析柱的再生和保存：通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂清洗可去除大部分的结合物质用 20%酒精保存或在缓冲液中加入 0。

02%叠氮钠可防止微生物生长4、在试验中应注意的问题1、 防止凝胶中有气泡2、 蠕动泵控制层析柱的流速，使用泵的压力不要超过凝胶的耐受程度3、 任何时候都不得使层析柱缓冲液流干，这样就不能进行正常层析分离了三、离子交换层析1、引言离子交换层析的目的是利用蛋白质表面的荷电基因与带相反电荷的不溶性基质结合，更确切地说，先用蛋白质偶极离子置换基质官能团上的平衡离子如氯离子或钠离子，然后蛋白质本身又随着平衡离子比例的增加而被置换下来这通常是通过增加洗脱液中的离子浓度来实现的，比如，用递增的盐浓度梯度进行洗脱另一种方法是，也可以用 pH 梯度洗脱，使被吸咐的蛋白质表面的净电荷减少在特定的缓冲液、pH 和离子强度的初始条件下，可以控制待分离蛋白表面的净电荷与基质相互作用离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂阳离子交换剂是在不溶性载体上结合有中性 pH 下向负电的官能团这类树脂适用于分离等电点在中性以上的蛋白质阴离子交换剂本身带碱性基因，在其 pK 以下荷正电，而阳离子交换剂则带酸性基因，在其 pk 以上荷负电应根据被吸附的蛋白质的性质来选择弱的或强的离子交换剂2、材料AKTA 层析仪层析柱分部收集器缓冲液Pka 可控制 pH 值范围 缓冲液用于阳离子交换树脂体系3.8 3.4-4.2 乳酸缓冲液4.8 4.4-5.2 乙酸缓冲液6.2 5.8-6.6 MES6.6 6.2-7.0 ADA7.2 6.8-7.6 MOPS用于阴离子交换树脂体系6.0 5.6-6.4 组氨酸缓冲液7.8 7.4-8.2 三乙醇胺缓冲液8.1 7.7-8.5 Tris8.8 8.4-9.2 二乙醇胺缓冲液9.5 9.1-9.9 乙醇胺缓冲液树脂：阴离子交换树指用于处理净电荷为负的蛋白质；阳离子交换树脂用于处理净电荷为正的蛋白质一些常用的离子交换树脂名称 类型 树脂基 吸附容量mg/ml层析速度cm/min稳定pH范围DEAE Sepharose Fast Flow弱、阴离子X-连接琼脂 3-110 12.5 1-14DEAE Sepharose CL-6B 弱、阴离子X-连接琼脂 2-170 1.7 2-14DEAE Sephace I 弱、阴离子珠状纤维素 10-160 0.17 2-12DEAE Sephadex A-50 弱、阴离子X-连接右旋糖苷 2-110 2-9DEAE Trisacryl M 弱、阴离子合成高聚物 80-90 3 1-11DEAE Bio-Get A 弱、阴离子X-连接琼脂 45 >0.3 2-9.5CM Sepharose Fast Flow弱、阴离子X-连接琼脂 15-50 12.5 2-14CM Sepharose CL-6B 弱、阴离子X-连接琼脂 10-120 2 2-14CM Trisacryl M 弱、阴离子合成高聚物 90-100 3 1-11Bio-Rex70 弱、阴离子合成高聚物 0.4-15 5-14CM Bio-Gel A 弱、阴离子X-连接琼脂 45 >0.3 4.5-10CM Sephadex C-50 弱、阴离子X-连接右旋糖苷 7-140 6-10Q Sepharose Fast Flow 强、阴离子X-连接琼脂 3-120 6.7-11.7 2-12QAE Sephadex A-50 强、阴离子X-连接右旋糖苷 1.2-80 2-10SP Sepharose Fast Flow 强、阴离子X-连接琼脂 60 12.5 3-14SP Sephadex C-50 强、阴离子X-连接右旋糖苷 8-110 2-10SP Trisacryl M 强、阴离子合成高聚物 100 6 1-113、步骤1、高子交换层析中溶液 pH 值的选择1）在九个 EP 管中各放入 1ml 阴性离子交换树脂（如 DEAE sepharose CL-6B）2）用 10ml 0.5mol/L, pH 值为 5.0 的缓冲液润洗一号 EP 管后；加入 10mmol/L NaCl 的缓冲液平衡树脂，二号管以 pH 值为 5.5 的缓冲液同法处理；以后各 EP管所用缓冲液 pH 值依次增加 0.5 个单位。

3）去掉多余缓冲液，保证各 EP 管中缓冲液高出树脂量为 1ml4）向各 EP 管中加入 100ul 蛋白质溶液5）混匀 EP 管中物质，放置几分钟6）检测上清液中是否存在目的蛋白离子交换层析的最佳实验条件围绕蛋白质性质而制定，还要顾及到不要使溶液 pH 值与蛋白质等电点相差太远选择条件时，正式洗脱后均须用浓度更大的 NaCl 溶液再次洗脱以判断洗脱效果，蛋白质活性必须进行测定对一些与阴性离子交换树脂无反应的特殊蛋白质，可用阳性离子交换树脂，重复试验2、洗脱条件的选择自适的反荷离子可以大大简化蛋白质的纯化，缓冲体系选定后，就该进行反荷离子的选择试验了以下是一个实例：1）用含 50mmol/L Tris 缓冲液（pH 值为 7.9） ，10mmol/L NaCl 的溶液平衡10m(DEAE Sepharose CL-6B 离子交换树脂)2）在九个 EP 管中各加入 500ul 离子交换树脂3）用含 0.1mol/L NaCl, 50mmol/L Tris 缓冲液（pH 值为 7.9）的溶液 10ml 润洗二号树脂十次，使树脂与 0.1mol/L 的 NaCl 平衡4）同法处理三至九号树脂，但润洗液中 NaCl 浓度由三至九号依次为：0.2mol/L; 0.3mol/L, 0.4mol/L, 0.5mol/L, 0.6mol/L,0.8mol/L, 1.0mol/L5）去掉多余溶液，保证各管中溶液高出树脂量为 500ul6）向各试管中加入 100ul 蛋白质溶液7）混匀 EP 管中物质，放置几分钟8）检测上清液中是否存在目的蛋白随着溶液中 NaCl 浓度的增加，上清液中将会出现蛋白质。

若溶液中 NaCl浓度在 0.1mol/L 这样低的水平时上清液就含有蛋白质，就需要改变 pH 值以提高蛋白质与树脂的结合力了若目的蛋白在 NaCl 浓度仅低于。