实验二 RNA提取.docx

实验二小量法提取植物总RNA1 实验目的：通过本实验的学习，了解植物RNA的提取方法，原理；掌握分子生物学实验的 基本方法2 材料长春花叶片3 试剂：裂解液RL,去蛋白液RW1,漂洗液RW，RNase-free ddH2O,DnaseI,缓冲液RDD4 仪器设备 离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、枪头、冰箱、电子天平、高 压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等4.1实验用的枪头，离心管,PCR管子，以及用于临时盛放Buffer的瓶子均用0.1% DEPC水泡过夜，然后灭菌两次，80°C烘干4.2实验用的镊子，药匙，研钵，高压灭菌（121C, 20min）两次5 方法与步骤：5.1 RNA 提取1. 匀浆处理:50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，取少量样品于RNAfree离心管， 加入1 mlTRIzol，用漩涡震荡仪混匀，静置5min2. 加入0.2ml氯仿，来回颠倒15s，静置2〜3min12000rpm， 4C，离心15min， 吸取上清液（约500”）于新的RNAfree离心管3•缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225ul），混匀（此时可能会出现 沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3（无色透明）中，12000rpm离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将收集柱CR3放回收集管中。

4. 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，静置几分钟，12000rpm离心30-6- 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中5. DNase1工作液的配制：取10ulDNase 1储存液放入新的RNase-free离心管中， 加入70ulRDD溶液，轻柔混匀6. 向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase1工作液，室温静置15分钟7. 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，静置几分钟，12000rpm离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中8. 向吸附柱CR3中加入漂洗液RW （使用前先检查是否已加入乙醇），室温静置2 分钟，12000rp m离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中9. 重复步骤8.10.12000rpm离心2分钟，倒掉废液将吸附柱CR3置于室温放置2分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液11. 将吸附柱CR3放到一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 70ulRNase-free dd H2O,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，得到RNA溶液取10ul 放于RNase-free小管中，用于跑胶和测浓度；剩余的60ul放于RNase-free离心管中 -70 °C保存（在冰上进行）。

12. 琼脂糖凝胶电泳13. 测RNA浓度（Nano Drop）、260/280、260/2305.2 RNA 反转为 cDNAlOyl体系 mix 2yl RNA 500ngAdd H O to lOylPCR程序 37 C 10min85 C 5s稀释产物即可用于后续实验6 实验结果：7 实验分析：高质量RNA提取是进行Northern blotting、体外翻译和建立cDNA文库等分子 生物学研究的前提早期高质量RNA的提取有很大难度，因为提取过程较繁复，RNA 极易被RNA酶水解，以及RNA酶来源广泛又非常稳定庆幸的是，自Chomczyski和 Sacchi（1987）提出异硫氰酸胍一步法提取RNA以来，该状况有了很大的改善一步 法的核心是采用 RNA 酶的抑制剂－异硫氰酸胍和巯基乙醇抑制 RNA 酶的活性在 PH5.3酸性环境中，DNA和RNA分别主要分配在有机相和水相中，蛋白则经有机溶 剂变性而除去因此，含RNA，DNA和蛋白的水溶液经有机溶剂变性和分相一步处理, DNA主要游离进入有机相，而蛋白则变性水相剩下有RNA、RNA酶的抑制剂、未变 性的蛋白和少量DNA水相再经重复的变性和分相处理，就只剩下RNA和RNA酶的抑 制剂，经醇沉淀可获得高质量的RNA。

一步法提取简单，RNA始终被RNA酶的抑制剂 所保护，对许多材料效果显著Trizol 法也基于相类似的原理但遗憾的是，一步法不能提取富含（水溶性） 多糖和多酚等物质中的高质量RNA因为这些物质的许多理化性质与RNA相似，如多 糖也主要分配在水相，也可被醇沉淀更糟糕的是，含多糖和RNA的水相一经醇沉 淀，多糖易与RNA共沉淀，此时RNA便不能再溶解目前的对策有：第一，用SDS-盐酸胍、高浓度Na+或K+离子改变多糖的溶解 特性，使其主要分配在有机相中，此时通过苯酚和氯仿抽提可去掉部分的多糖第二，选择性沉淀多糖或RNA，如LiCl沉淀RNA，多糖则留在上清液中；低浓度 乙醇（10% ~30% ）沉淀多糖，而RNA则要在75%乙醇中才能沉淀下来；醋酸钾溶液 沉淀多糖；低浓度乙醇和醋酸钾溶液共同沉淀多糖；在高浓度的N aC l下，经低浓度 乙醇或2-丁氧乙醇来沉淀多糖但即使如此，仍有相当多的多糖与RNA混杂在一起 第三，在沉淀RNA之前，再米用乙二醇丁醚分相把多糖去掉多酚和色素等次生代 谢物质极易被氧化成红褐色物质，然后与核酸不可逆的结合目前对策有：（1）加 入巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）等，防止酚类物质被氧化，NaBH4等；（2）加螯 合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），其3O-N=基有很强的 结合多酚化合物的能力，两者形成稳定的复合物，使之不能成为多酚氧化酶的底物 而被氧化；（3）^叮ris-硼酸（pH7.5），硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复 合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合；（4）-70°C的丙酮抽提冷冻 研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材 料中分离到高质量的RNA；（5）低卩円值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合 物的氧化。

必须指出的是，尽管已从许多材料包括富含多糖的材料中提取了高质量 的总RNA，但用同一方法所得结果相差很大，如有人报告CTAB法对提取富含多糖的 总RNA提取很有效很好的一篇关于 RNA 抽提的综述文章对大部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多事实上，现有的 RNA抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便， 成功率也更高那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA降解和组织内杂质的残留关于降解问题， 首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解现有的 RNA 抽提试剂，都 含有快速抑制 Rnase 的成分在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所 有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解细胞被裂解后，裂解液中的有效成 分立即抑制住细胞内的Rnase,所以RNA得以保持完整也就是说，培养细胞由于 很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解 反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致因此， 假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可 以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法但是，液氮碾磨方法非常麻 烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉这样就产生了退而求其次的方 法：匀浆器匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个 问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快电动匀浆 器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象 的因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃 匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决影 响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同总之， 如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法 / 试剂进行优化优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类 的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质-用嘴碾 磨，肠胃抽提究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重 要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用当然，您的选 择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。

实验前方法/试剂的选择0：抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同 cDNA 文库构建要求 RNA 完整而 无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要 求较低； RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格投 入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财1：样品的收集/保存-影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA,降解 速度与内源酶含量及温度有关传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性： 立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻这两个办 法都要求操作快速后者适合所有的样品,而前者只适合细胞及内源酶含量较低的 并且较容易匀浆的组织具体地讲,植物组织,肝脏,胸腺,胰腺,脾脏,脑,脂 肪,肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来,再往下做2：样品的破碎及匀浆-影响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆,匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来 细胞无须 破碎即可直接匀浆,组织需要破碎后才能匀浆,酵母菌和细菌需要先用相应的酶破 壁后才能匀浆。

内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器 一次完成破碎和匀浆过程；植物组织,肝脏,胸腺,胰腺,脾脏,脑,脂肪,肌肉 组织等样品,它们不是内源酶含量高,就是不容易匀浆,所以必须将组织的破碎和 匀浆分开操作最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨,最可靠的匀浆 方法是使用电动匀浆器使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中,样品 不得融化,因为冷冻后内源酶更容易起作用3：裂解液的选择-影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性,因此,选择裂解液的重点是要结合纯化方 法一起考虑只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增 加灭活内源酶的能力4：纯化方法的选择 - 影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果但对 于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯 化方法是至关重要的柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶 反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以 获得满意的结果，但操作时间长。

RNA 抽提的“三大纪律八项注意”纪律一：杜绝外源酶的污染注意一：严格戴好口罩，手套注意二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处 理注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free纪律二：阻止内源酶的活性注意四：选择合适的匀浆方法注意五：选择合适的裂解液注意六：控制好样品的起始量纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降注意八：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率RNase 污染的 10 大来源1：手指头-手指头是外。