基于微流控技术制备高载药量叶酸靶向的卡巴他赛白蛋白纳米粒.doc

基于微流控技术制备高载药量叶酸靶向的卡巴他赛白蛋白纳米粒在全球范围内，恶性肿瘤导致的死亡仅次于心脑血管病，严重威胁人类健康 冃前，在恶性肿瘤的临床治疗中，化学治疗是最常用的手段之一卡巴他赛（CTX） 是新一代半合成的紫杉烷类药物,对多种恶性肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，在 恶性肿瘤的治疗上具有广泛的应用前景但CTX存在溶解度差、无选择性等问题,在治疗过程中需要添加助溶剂吐温 80 （Tween 80），易产牛严重的过敏反应而且化疗药物在抑制肿瘤增长的同时, 会对机体正常组织器官造成伤害，这限制了 CTX在恶性肿瘤治疗上的应用冃前, 将紫杉烷类化疗药物包载于白蛋白纳米粒中是捉高药物溶解度、降低毒副作用的 常用策略之一传统方法制备的白蛋白纳米粒多会有交联剂或II类有机试剂残留，这可能会 对机体造成危害;而H常规方法制备的白蛋白纳米粒多存在粒径分布较宽、载药 量（EC）低、缺乏主动靶向性等问题，限制了白蛋白纳米粒在临床中的应用微 流控（MF）技术能在微米级的尺寸范围内精准控制液体流动，具有较高的混合效 率，制备的纳米制剂粒径分布均一、EC高、批次间差异性小为了降低紫杉烷类 化疗药物的毒副作用，提高其肿瘤杀伤效果，本课题拟基于MF技术，以人血清白 蛋白（HSA）为材料，构建具有叶酸（FA）靶向的包载CTX的白蛋白纳米载药体系。

首先利用HSA自组装的方式，制备无交联剂和II类有机试剂残留的CTX白蛋 白纳米粒（BU-XPs-CTX）,利用FA对BU-XPs-CTX进行化学修饰，得到FA-NPs-CTX, 以增强BU-XPs-CTX的靶向递送能力然后基于MF技术，对纳米粒的制备方式进合MF技术和化学修饰的策略，制备具有FA靶向的高EC白蛋白纳米粒(FA-PEG-NPs-CTX),将化疗药物靶向递送至肿瘤部位，进而取得良好的肿瘤治疗 效果本论文研究主要包括以下研究内容：1・CTX体内外分析方法的建立为了能 对CTX进行精准的定量，建立CTX的体内外分析方法首先，利用高效液相色谱 (IIPLC)建立CTX的体外分析方法结果显示,CTX的体外检测具有较好的专屈性，在1. 0-500. 0 u g/mL的范围内 线性关系良好;而H该分析方法的精密度、准确度、稳定性和加样回收率的相对 标准偏差(RSD)均小于3.0%,符合相关要求其次,利用三重四级杆串联质谱建 立CTX的体内分析方法，以卡马西平(CBZ)为内标，分别建立CTX的血浆和组织 器官含量检测方法结果显示，在血浆和组织器官内，CTX具有较好的专属性，并 且在10. 0-500. 0 ng/mL范围内具有良好的线性关系;CTX在血浆样品中的回收率 在83. 8-85. 7%之间，基质效应在72. 7-81. 1%之间。

该分析方法的精密度、准确度和稳定性的RSD均小于15. 0%,符合相关要求， 可以准确地进行CTX的定量分析2.FA靶向白蛋白纳米粒的制备及体内外性质 评价结合课题组前期工作基础，本课题釆用HSA自组装的方式制备BU-NPs-CTX, 整个制备过程不引入交联剂和II类有机试剂，具有良好的生物安全性然后在BU-NPs-CTX表面以酰胺键连接FA,制备FA靶向的纳米粒FA-NPs-CTX 在37C、10%胎牛血清(FBS)中孵育48 h, FA-NPs-CTX的粒径增加量小于30 nm, 说明该制剂具有良好的血清稳定性细胞摄取结果显示，经FA受体(FR)介导， 在4 h内，HeLa.细胞对FA-NPs-CTX的摄取量是BU-NPs-CTX的2. 87倍在细胞毒性实验评价中，FA-NPs-CTX对HeLa细胞的杀伤效果显著强于BU-XPs-CTXo利用小鼠半数致死量（LD₅₀₅₀为 5. 68 mg/kg,而 BU-NPs-CTX 和 FA-NPs-CTX在CTX浓度为400 mg/kg时仍未出现小鼠死亡，安全给药剂量提高70 倍以上。

构建HeLa荷瘤裸鼠模型，活体成像及组织分布结果显示FA-NPs-CTX能在肿 瘤部位靶向聚集与BU-NPs-CTX相比,FA-NPs-CTX对HeLa荷瘤裸鼠的肿瘤生长 抑制率由65. 8%提高至80. 5%,展现出更好的肿瘤抑制能力与Tween-CTX相 比,FA-NPs-CTX在肿瘤抑制能力上无显著性差异，但Tween-CTX组体重下降明显, 组织病理学切片中心、肝、肺和肾的严重损伤证明了 Tween-CTX具有强烈的毒副 作用3.基于MF技术制备高EC的MF-NPs-CTX及体内外性质评价为了提高白蛋 白纳米粒的EC,提高白蛋白纳米粒的药物递送效率，本章节基于MF技术,利用自 主设计的倒W型被动混合芯片，制备MF-NPs-CTXo溶有CTX的有机相与水相在倒 W型被动混合芯片中高效混合，混合过程的雷诺系数<150,液体处于层流混合 状态由于整个混合过程不引入交联剂和II类有机试剂，因此制备的MF-NPs-CTX 具有良好的生物安全性通过单因素优化的方式，以纳米粒的包封率（EE）及粒 径作为考察指标,优化出MF-NPs-CTX制备工艺与BU-NPs-CTX相比,MF-NPs-CTX 的EE由51. 4%提高至84. 3%,提高了 64%;EC由5. 7%提高至15. 6%,提高了 1. 74 倍;与此同时,MF-NPs-CTX粒径分布更加均一，多分散性系数（PDI） <0. U差示扫描量热分析结果证实CTX在白蛋白纳米粒内部形成新的物相，而非简 红细胞溶血率仍低于5. 0%,表明MF-NPs-CTX生物安全性好，可用于静脉注射给药。

构建PC-3荷瘤裸鼠模型，活体成像及组织分布结果表明，粒径分布均一的 MF-XPs-CTX在肿瘤部位聚集更多;粒径分布较宽的BU-XPs-CTX则在肝脏中聚集 明显在HeLa荷瘤裸鼠的肿瘤抑制实验中，Tween-CTX、BU-NPs-CTX和MF-NPs-CTX 的肿瘤生长抑制率分别为51. 4%、31.8%和53. 5%, MF-NPs-CTX的肿瘤抑制效果显 著优于BU-NPs-CTXo 4.基于MF技术制备FA靶向的FA-PEG-NPs-CTX及体内外性 质评价结合MF技术和化学修饰的方法，将FA-PEG连接到MF-NPs-CTX表面，制 备 FA-PEG-NPs-CTX与MF-NPs-CTX相比，FA-PEG-NPs-CTX粒径增大约25 nm利用透射电子显微 镜对FA-PEG-NPs-CTX进行外观形态观察，结果显示,FA-PEG-NPs-CTX呈球形，粒 径大小均一激光共聚焦显微镜结果显示，在1-4 h内，HeLa和A549细胞对 FA-PEG-XPs-CTX的摄取呈时间依赖性;流式细胞仪检测结果显示，经FR介 导,HeLa 对 FA-PEG-NPs-CTX 的摄取量是 MF-NPs-CTX 的 2. 73 倍(4 h);而 FA 阻 滞后，HeLa对FA-PEG-NPs-CTX的摄取量与MF-NPs-CTX相比无显著性差异。

在I【eg荷瘤裸鼠模型中，组织分布实验结果显示,FA-PEG-NPs-CTX在肿瘤部 位荧光强度显著强于MF-NPs-CTXo肿瘤生长抑制结果显示,FA-PEG-NPs-CTX对肿 瘤牛长的抑制率为 74. 1%,显著高于 MF-NPs-CTX(44. 2%)和 Tween-CTX(59. 3%) 采用SD大鼠进行药物的血浆药代动力学评价,FA-PEG-NPs-CTX药时曲线下而积 (AUC_last 能力本课题基于MF技术制备了 FA靶向的白蛋白纳米粒，构建了一个安全、高 效、EC高,且批次间差异性小的药物递送体系，克服了常规白蛋白纳米制剂中交 联剂或II类有机试剂残留的问题，同时提高了白蛋白纳米粒的靶向递送能力，增 强了药物对肿瘤细胞的杀伤能力,在恶性肿瘤的抑制中取得了较好的效果本课 题可为制备靶向纳米制剂递送化疗药物捉供参考，对于靶向的白蛋白纳米制剂的 临床应用具有较好的推动作用。