吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与冠心病的相关性研究【临床医学论文】.doc

临床医学论文-吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因 G894T 多态性与冠心病的相关性研究【摘要】 目的　探讨吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因（eNOS）G894T 多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的发生及其严重程度间的关系方法 将 203 例吸烟者和 182 例非吸烟者根据冠状动脉造影结果分为冠心病组(196 例)和对照组(189 例)，以冠状动脉病变支数判定严重程度以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测 eNOS 基因 G894T 多态性，按吸烟与否分析G894T 多态性与冠心病的关系结果 冠心病组 GT+TT 基因型分布与 T 基因突变频数明显高于对照组（χ2＝4.26、6.21，P 均﹤0.05）；吸烟者基因 GT+ TT 型及 T 等位基因频率均显着高于非吸烟者(χ2＝5.82、5.77，P 均﹤0.05)；冠心病组 eNOS 基因型分布在单支与多支病变组之间差异无统计学意义（χ2＝3.36，P﹥0.05），而吸烟的冠心病患者差异有统计学意义（χ2＝6.48，P﹤0.05），吸烟的 GG+TT 型者更可能发生多支病变，OR＝3.42，95％CI（1.440~4.400）。

结论 eNOS894 位点 G→T、吸烟与冠心病的发生及其严重程度间的关系密切 【关键词】 冠心病 内皮型一氧化氮合酶基因 G894T 多态性 吸烟[Ａｂｓｔｒａｃｔ] Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the relationship between the eNOS G894T polymorphism and the presence and the severity of coronary artery disease (CAD) concerning with smoking. Methods All patients were divided into two groups of CAD and non CAD, including 203 smokers and 182 cases without smoking by coronary angiograms. The severity of CAD was expressed by the number of affected vessels. Polymerase chain reaction (PCR) with restriction fragment length polymorphism analysis was used to detect the G894T variant of the eNOS gene in 196 patients with CAD and 189 controls. The relationship between CAD and G894T polymorphism was analyzed based on smoking or not. Results The frequency of the eNOS GT and TT genotypes in the CAD group was more than that in control group（χ2＝4.26,P﹤0.05）, allele frequency was significantly different（χ2＝6.21,P﹤0.05）;there were significantly differences between smokers and those without smoking too(χ2＝5.82，5.77，P﹤0.05); the frequency of the eNOS GT and TT genotypes between the different number of affected vessels was not significantly different in CAD（χ2＝3.36，P﹥0.05），but it was significantly different in smokers with CAD（χ2＝6.48，P﹤0.05）; the coexistence of the 894 GT or TT genotypes and smoking led to an increased risk of severe CAD, OR＝3.42，95％CI 1.440~4.400. Conclusions These findings suggest that the G894T polymorphism of the eNOS gene, smoking were associated with the presence and the severity of CAD.[Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ] coronary artery disease；　endothelial nitric oxide synthase gene；　G894T polymorphism；　smoking高血压、高脂血症、吸烟、糖尿病等作为冠心病的危险因素已被广泛接受，但控制这些传统的冠心病危险因素并不能完全阻止动脉粥样硬化的发展，目前其一级预防和二级预防的成绩与逐年上升的发病率、死亡率相比不容乐观。

因此，遗传因素和环境因素日益受到重视本研究通过对吸烟者的内皮型一氧化氮合酶 eNOS 基因 G894T 多态性分析吸烟者 eNOS 基因 G894T 多态性与冠心病的关系，从而初步了解传统的冠心病危险因素、遗传因素在冠心病发生、发展中的相互作用1　资料与方法1.1　一般资料　入选对象 385 例均为 2004 年 11 月至 2006 年 10 月浙江大学医学院附属第二医院的住院患者，包括 203 例吸烟者和 182 例非吸烟者所有患者之间无血缘关系全部经冠状动脉造影检查，由两位有经验的心内科及放射科医师共同进行分析作出判断左冠状动脉主干、前降支、旋支及右冠状动脉中任一支的内径变窄≥50%判定为狭窄性病变，并根据累及支数定义为单支、双支和三支病变, 累及左主干者记为双支病变，统计病变血管支数根据造影结果分为冠心病组和对照组(非冠心病组)两组一般资料见表 1，两组在性别、年龄、血脂水平和高血压、糖尿病比例等方面比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）1.2　标本收集及 eNOS 基因检测　抽外周静脉血 5ml, 用枸缘酸钠抗凝, 按快速盐析法提取 eNOS DNA采用 PCR 扩增 eNOS 基因的特异片段。

引物参照Hingorani 等[1]设计,其核苷酸序列为引物 A: 5'- CATGAGGCTCAGCCCCAGAA C-3'和引物 B: 5'-AGTCAATCCCTTTGGTGC TCAC-3'PCR 反应体系为 25μl,含10×PCR 缓冲液 2.5μl, 样本 DNA 2.5μl, Taq DNA 聚合酶 0.25μl (1U), dNTP 0.5μl,MgCl2 1.5μl,引物终浓度均为 0.5μmol/L PCR 程序：95℃热启动 5 min 后,95℃变性 45s, 60℃退火 45s, 72℃延伸 1min; 共 30 个循环后, 72℃延伸 5min 后冷却至 4℃限制性内切酶分析: 取扩增产物 10μl, 加入10×酶切缓冲液 2μl, 双蒸水 7μl,混匀后,加 1μlMboI 酶(10U)混匀, 37℃酶切 16h(上述引物与试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)1.3　统计学方法　以直接计数法计算 CAD 组患者和对照组的基因型和等位基因频率资料分析应用 SPSS10.0 软件包作统计学处理遗传平衡吻合度 χ2检验群体基因型分布是否符合 Hardy- Weinberg 平衡定律。

组间均数间统计学差异用 t 检验,各组基因型和等位基因频率之间的比较用 χ2 检验，相对危险度以比值比（OR）的 95％的可信区间（95％CI）来表示，设 P﹤0.05 为差异有统计学意义2　结果2.1　PCR 产物 MboI 酶切后电泳图谱　GG 基因型含 206bp 1 条带； GT 型含 206bp、119bp、87bp 3 条带； TT 型含 119bp、87bp 2 条带(见图 1)2.2　本研究中 385 例研究对象 eNOS 基因型分布 GG 型 314 例、GT 型 66 例、TT 型 5 例基因型频率经计算分别为 0.8156、0.1714 和 0.01299 G、T 等位基因频率分别为 0.9013 和 0.0987通过吻合度检验,eNOS 基因型和等位基因频率的分布符合 Hardy-Weinberg 平衡(χ2＝0.12 , P>0.05) ,说明样本具有良好的代表性,不存在选择偏倚2.3　冠心病组与对照组基因型分布及等位基因频率比较见表 2由表 2 可见，基因型分布及等位基因频率在冠心病组与对照组间比较均有统计学意义（χ2＝4.26、6.21，P 均﹤0.05）；在冠心病组吸烟者与对照组间比较差异有统计学意义（χ2＝7.97、10.58，P 均﹤0.01）。

2.4　吸烟者与非吸烟者基因型分布及等位基因频率比较见表 3由表 3 可见，吸烟者与非吸烟者基因型分布及等位基因频率比较差异有统计学意义（χ2＝5.82、5.77，P 均﹤0.05）2.5　单支病变与多支病变基因型分布对比见表 4由表 4 可见，基因型分布在冠心病组单支病变者与多支病变者间比较差异无统计学意义（χ2＝3.36，P﹥0.05），而在吸烟的冠心病单支病变者与多支病变者间比较差异有统计学意义（χ2＝6.48，P﹤0.05），且与冠心病组比较，吸烟合并 GT 或 TT 的冠心病者患多支病变风险增高，OR(95％Cl)为3.42(1.440~4.400)，P﹤0.013　讨论冠心病的病理基础是冠状动脉粥样粥样硬化引起的冠状动脉狭窄、斑块的破裂和出血导致血栓形成,吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病等危险因素都可能引起血管内皮结构不完整和功能不完全, 使 NO 生成和释放减少, NO 抑制血小板和白细胞粘附功能减弱,血小板等有形成分大量粘附聚集形成血栓, 引起血管腔狭窄, 甚至急性闭塞； NO 抑制血管平滑肌细胞增生作用减弱, 平滑肌细胞大量增生和迁移, 加速了动脉粥样硬化因此,冠心病的发生、发展可能与eNOS 基因变异有关。

而且，这种变异可能与前述各种传统的危险因素有密切关系eNOS 基因 G894T 多态性是指位于 eNOS 基因第 7 外显子上 894 位点的鸟嘌呤（G）转换为胸腺嘧啶（T），而出现不同于野生型 GG 的变异基因型GT、TTG894T 突变使编码的第 298 位谷氨酸被天门冬氨酸所取代，引起 eNOS 活性降低国外对 G894T 多态性与冠心病相关性的研究较多[2~6],但结果差异较大，不同种族被认为是世界范围内研究没有一致结果的最重要原因之一然而，在以同一种族为对象的研究结果也不尽相同[5，6]，比较一致的是几乎相关研究都认为冠心病患者 eNOS 基因 G894T 突变频率在单支、双支和多支病变组之间差异均无统计学意义在本次研究中发现冠心病组与对照组比较 eNOS 基因 GT+ TT 型分布及T 等位基因频率有显着差异，且突变的纯合型 TT 仅发生在冠心病组，说明G894T 基因突变可增加个体对冠心病的易感性同时，本研究将所有吸烟者与非吸烟者进行比较，以了解吸烟与 G894T 基因突变间的相互关系，结果发现吸烟者基因 GT+ TT 型及 T 等位基因频率均显着高于非吸烟者（P﹤0.05），提示吸烟可能诱发 G894T 基因突变。

因此我们推断吸烟者可能通过增加 G894T 基因突变而更易患冠心病为了证实这一点，本研究还将冠心病组中的吸烟者与对照组基因 GT+ TT 型分布及。