HSP70、Rb蛋白、HPV16E7蛋白在人喉癌发生中作用的研究.pdf

第二军医大学硕士学位论文HSP70、Rb蛋白、HPV16E7蛋白在人喉癌发生中作用的研究姓名：英信江申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：赵舒薇20050401独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意本人承担本声明的法律责任学位论文作者签名：嘲三i 2签字日期：≯卅7 年} 月，口日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书)⋯一繇目茏77 新躲趟钎救签字日期：a N 辂r 月，o 日签字日期：≯柝歹月I 汨H S P 7 0 、靛b 蛋囟、H 辨i 8 E 7 蛋囱在人喉癌笈室中作蠲的搿究喉癌声繁惑窝癌前瘸变热椿燕蛋叁入巍头癌病毒视阍膜母细胞瘸分子馋偶细胞周期蛋&表迭免疫缀织化学方法磷鼗簸缓{ 孛滚辣椴过氧化物酶碱灌磷酸酶痰毽分级临床分期中英文对照l a r y n xc a r c i n o m av o c a lc o r dp o l y p sp r e c a r c i n o m ah e a ts h o c kp r o t e i n ，H S Ph u m a np a p i l l o m a v i r u s ·鼬Vr e t i n o b l a s t o m a ，R bm o l e c u l a rc h a p e r o n e sc e l lc y c l ep r o t e i ne x p r e s s i o ni m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o dp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n ，P B Sh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，脚a l k a l i a n ep h o s p a t a s e ，A Ph i s t o p a t h o l o g i c a lg r a d ec l i n i c a ls t a g e⋯一～! i ! ! ! ：塑篓塑：i 登i ! ! ! 要塞奎盎邀鳖楚妻室堡望楚堑窭中文摘要l 瓣豹】本项研究为凰家自然料学基金资助课题分课愿( 3 0 3 7 1 6 1 0 ) 。

喉瘸是耳彝咽喉稀常觅麴恶性肿瘤，近年来发病率宥鲷鬟的增高趋势，毽瓣葵发蒺辍{ | ；《滏不鏊潺楚大蹙磷究已袭鞠，喉瘘羚笈生与壤溺、饮灞、人襞头瘥瘸遴感染等多瓣嚣索糨美，我稻以霉圭的磺究也谖实了蜈瘗与高危趔人乳头瘸病灏1 6 型密切相哭为进～步探讨喉癌发缴的生物学橇裁，我翻对人壤滢缝织不澍瘸瑾除段、喉癌不鞠癀莲分缀耪添痰分期的缎织拣本中H S P 7 0 、R b 嚣巍和H P V l 6 E 7 爨文黪表达遂行检测，搽讨入嗾癌缝缎中H S P 7 0 、R b 蛋囱和I - I P V l 6 E 7 蛋囱豹表达及其与喉癌发生、发震髓榻互关系，拼究H S P 7 0 、R b 鬣囱和H P V l 6 E 7 鬣稳在嚷癌笈燕串的作用和机制，为喉瘸发生、发展提供一种新的矜子生物学依摄，为喉癌的早期诊断和辫治提供一种新的途径l 方法】教祭我辩1 9 9 6 警1 舄鬟2 0 0 3 掣6 旁擎术韬豫豹喉不溺瘸黛组织标本共1 3 8 例，其中喉癌7 8 例，喉癌前瘸变2 6 例( 慢性肥厚性喉炎非热烈增生1 5 例，声带崮斑1 t 铡) ，声带息肉2 4 例，瘸髑正常喉组织( 躐肿瘤>t ．0 c m ) 1 0 镄。

獭漕纛旨7 8 秘中，瑟s 5 德，女2 3 餐；年龄4 4 —7 9 爹，平浚( 6 1 ．5 ±1 0 ．9 ) 爹l 接1 9 8 7 年爨鼯羧瘀联溅( u t c c ) 拣攀避簿妊疼分期，其中I 期1 4 倒，I I 期1 3 例，I I l g q2 5 例，Ⅳ期2 6 倒；按肿瘤分化稷度将葵分是3 缀，蕤孛{ 缀( 毫发分偬) 2 1 餐，I I 缀( 孛发分织) 3 0铡，{ l l 缀( 低度分捷) 2 7 铡爨套据本穗缀l O ％{ 孛性攒尔弩抟溶滚圈定，常溉瑟蟥包埋采羯燕痰缀织化学E n V i s i o n 法梭测组绞捧奉中H S P 7 0 、R b 蛋翻和H P V l 6 E 7 鬣白韵寝达情况l 结暴l2H S P 7 0 、釉蚕白、H P ? 1 6 E 7 蛋自在人喉癌发生中作用的研究程癌周正鬻曦组缓、声带怠肉、喉癌静瘸变和喉癌组织中H P V l 6 E 7蛋臼的阳性表达率分别为0 ％( 0 ／1 0 ) ，4 ．1 ％( 1 ／2 4 ) ，2 7 ．O ％( 7 ／2 6 ) 和4 3 6 ％( 3 们8 > ，R b 蛋白豹霸瞧波这率分裂舞8 0 ．0 ％( 8 1 1 0 ) ，7 9 。

2 ％( t 9 ／2 4 ) ，6 1 ．5 ％( 1 6 ／2 6 ) 和5 0 ．O ％( 3 9 ／7 8 ) ，H S P 7 0 的阳惶表达率分别为O ％( 0 ／1 0 ) ，8 ．3 ％( 2 ／2 4 ) ，5 0 ．0 ％( 1 3 ／2 6 ) 纛6 9 2 ％( 5 4 ／7 8 ) ；在猴潼瘸理分缀l 、{ {和I I I 级中H P V l 6 E 7 蛋白的阳性表达率分别为2 8 ，6 ％( 6 ／2 1 ) ，3 6 ．7 ％( 1 1 ／3 0 )秘6 3 ．O ％( 1 7 ，2 7 ) ，R b 蛋囱的阳性表达率分剐为7 1 ．4 ％( 1 5 ／2 1 ) 5 6 7 ％( 1 7 ／3 0 ) 和2 5 ．9 ％ ，穗藤l { l 一Ⅳ期缓显离予{ 一l l 麓( P 1 ．O c m ) 1 0 例喉癌患者7 8 例中，男5 5 例，女2 3 例：年龄4 4 ～7 9 岁，平均( 6 1 ．5±1 0 ．9 ) 岁：按1 9 8 7 年国际抗癌联盟( U I C C ) 标准进行临床分期，其中I 期1 4 例，I I 期1 3 例，I I I 期2 5 例，Ⅳ期2 6 例：按肿瘤分化程度将其分为3 级，其中I 级( 高度分化) 2 1 例，I I 级( 中度分化) 3 0 例，I I I 级( 低度分化) 2 7 例。

所有标本均经1 0 ％中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋二、主要试剂与仪器l 试剂实验用兔抗人H S P 7 0 单克隆抗体、兔抗人R b 单克隆抗体和兔抗人H P V l 6 E 7 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，所用E n V i s i o n T M + ( K 4 0 0 6 ) 免疫组织化学染色试剂盒购自D A K O 公司2 仪器低温冰箱、烘箱、切片机、光学显微镜等三、方法与步骤( 免疫组化E n V i s i o n 法检测)1 基本原理E n v i s i o n 法是以组织细胞切片为目标原示踪抗原或抗体的免疫酶技术，抗原和抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物酶复合物( E n V i s i o n 复合物) 与第一抗体结合，进而由免疫酶催化相应底物进行显H S P 7 0 、R b 蛋爨、t f P V l 6 E 7 蛋鑫在入壤瘸发生孛箨蠲豹研究色，对某种待检大分予物质进行定性、定位域定量测定E n V i s i o n 复合物是利用一种多聚化合物，将H R P 或A P 和籍二抗体( 抗鼠或抗氮I g G )同时标记在一个多聚亿食物上，即形成酶．多爨纯合物。

第二抗体睡大复合秘簿一个m o l 靛复食秘中约窘7 0 个m o l 鹣H R P 亵1 0 个t o o l 的第二抗体，复合物中的H R P 的绝对数量远高于其它复合物( 如A B C ) ，本身己具镛高度放大作用，E n V i s i o n 法敏感性显著瀚于其它方法复含物中存在多个第二抗体，也增加了该复台物与特异性抗体的结合机会阅时，该多聚纯合物入终蠹不存农，无{ } 特异毪于撬，耱爨染色轻该方濠染色步骤为两步，且第二抗体孵肖时较短，省时搿简便2H S P 7 0 检测1 ) 石蜡切片脱蜡靴水化组织切片：2 ) 蒸壤求洗，甥跨效入0 ．0 1 M 狩橡羧熬缓洚渡( P H 6 O ) ，嶷竣亳压煮沸修复抗原，冷却麟蒸馏承洗，用P B S ( P H 7 ．4 ) 冲洗三次，每次3 ～5分钟；3 ) 每张切片加l 滴3 ％过氧化氢( H 2 0 2 ) ，室温下孵育1 0 r a i n ，用以清滁内源性遭氧化貔黪，蒸镄东漂洗；4 > P B S 滓洗3 ×5 分镑；5 ) 每张切片加1 滴单克隆抗体H S P 7 0 ，4 “ C 过夜；6 ) P B S 冲洗3 ×5 分钟；7 ) 每张切片加l 滴E n V i s i o n T M + 复含物，室温下孵育3 0 m i r aS ) P B S 跨浚3 x 5 分锈；9 ) 每张切片加D A B ．H 2 0 2 显色，显徽镜下观察5 - 1 0 分钟；1 0 ) 蒸馏水冲洗，苏木素复染，中性树胶固定，镜检。

3H P V l 6 E 7 蛋白检测1 ) 夏疆弼冀残蟮黢泰纯经缓密片；2 ) 蒸馏水洗，切片放入0 ．0 1 M 柠檬酸簸缓冲液( P H 6 + O ) ，巍接高压煮沸修复抗原，冷却厨蒸馏水洗，用P B S ( P H 7 ．4 ) 冲洗三次，每次3 - 5分钟；3 ) 每张留片热l 瀵3 ％过氧化氢( H 2 0 2 ) ，室温下孵弯1 0 m i n ，惩默! ! ! ! ! ：塑萋垒：! 型! ! ! ! 笙垒垄叁鳖遐蕉竺主堡塑箜堑塞清除内源性过氧化物酶，熬馏水漂洗：4 ) P B S 冲洗3 ×S 分钟；5 ) 每张谤片热l 溃肇夷隆蕊馋H P V l 6 E 7 ，4 “ C 过夜；6 ) P B S 狰洗3 ×5 分镑；7 ) 每张切片加1 滴E n V i s i o n T M + 复合物，室温下孵育3 0 r a i n ：8 ) P B S 冲洗3 ×5 分钟；9 ) 每张切片加D A B ．H 2 0 2 显色，显微镶下蕊察5 ～l O 分镑；1 0 ) 蒸谣瘩泞洗，苏本素复染，中整辩羧强定，镜捻4 R b 蛋白检测1 ) 石蜡切片脱蜡和水化组织切片；2 ) 蒸馏水洗，切片放入0 ．0 1 M 柠檬酸盐缓净液( P H 6 ．O ) ，纛攮高压煮沸穆复抗嚣，冷却器蒸落农洗，矮P B S ( 鞭7 ．4 ) 捧洗三次，簿次3 ～5分钟：3 ) 每张切片加1 滴3 ％过氧化氢( H 2 0 2 ) ，室温下孵育1 0 m i n ，用以清除内源性过氧化物酶，蒸馏水漂洗；4 ) P B S 渖洗3 ×5 分镑；5 ) 每张切片热l 滴肇克隆抗体R b ，4 “ C 避夜；6 ) P B S 冲洗3 ×5 分钟；7 ) 每张切片加1 滴E n V i s i o n T M + 复合物，室温下孵育3 0 m i r a8 ) P B S 冲洗3 ×5 分镑；9 ) 每张韬片热D A B ．1 4 2 0 2 显色，显徽铙下蕊察5 ～l O 分锋；1 0 ) 蒸馏水冲洗，苏木素复染，中性树胶固定，镜检。

四、免疫组化结果阳性判定染色时，用已知粥设的塞颈癌病例佟阳健对照，尾P B S 替代一抗作鹚瞧黯照阳性细胞判定标凇：H S P 7 0 为细胞浆染色，以细胞浆出现棕色颗粒为阳性：R b 蛋白和H P V l 6 E 7 蛋白均为细胞核。